Transkriptom Analys av enskilda celler

Summary

I denna artikel beskriver vi en enkel metod för skörd av enstaka celler från råtta primära neuronala kulturer och efterföljande transkriptom analys med ARNA förstärkning. Detta tillvägagångssätt är generaliserbara till alla celltyper.

Abstract

Många genuttrycksanalys tekniker förlitar sig på material som isoleras från heterogena populationer av celler från vävnader homogenat eller celler i kultur. ^1,2,3 Vid hjärnan, regioner, såsom hippocampus innehåller ett komplext arrangemang av olika celltyper, alla med distinkta mRNA profiler. Förmågan att skörda enskilda celler möjliggör en mer djupgående undersökning av de molekylära skillnaderna mellan och inom cellpopulationer. Vi beskriver en enkel och snabb metod för att skörda celler för vidare bearbetning. Pipetter som ofta används i elektrofysiologi används för att isolera (med aspiration) en cell av intresse och bekvämt sätta in den i ett Eppendorf-rör för ytterligare behandling med valfritt antal av molekylärbiologisk teknik. Våra protokoll kan modifieras för skörd av dendriter från cell kultur eller till och med enskilda celler från akut skivor.

Vi beskriver också den ARNA förstärkning metoden som en stor nedströms tillämpning av en enda cell isolering. Denna metod har utvecklats tidigare av vårt labb som ett alternativ till andra analyser genuttryck tekniker som omvänd transkription eller realtid polymeraskedjereaktion (PCR). ^4,5,6,7,8 Denna teknik ger linjär amplifiering av polyadenylated RNA börjar med bara femtograms av material och resulterar i mikrogram mängder av antisense-RNA. Den linjärt förstärks materialet ger en mer exakt bedömning än PCR-exponentiell amplifiering av den relativa förekomsten av komponenter i transkriptom av de isolerade cell. Den grundläggande proceduren består av två rundor av förstärkning. Kortfattat är en T7 RNA-polymeras promotor sajt införlivas dubbelsträngad cDNA skapas från mRNA transkript. En övernattning för in vitro transkription (IVT) reaktion utförs därefter som T7 RNA-polymeras producerar många antisense avskrifter från strandade dubbla cDNA. Den andra omgången upprepar detta förlopp men med vissa tekniska skillnader eftersom utgångsmaterialet är antisense-RNA. Det är standard att upprepa den andra omgången, vilket resulterade i tre rundor av förstärkning. Ofta är den tredje rundan för in vitro transkription reaktion utförs med hjälp biotinylerad nukleosid trifosfater så att antisense-RNA produceras kan hybridiseras och upptäcks på en microarray. ^7,8

Protocol

1. Cell Culture

Vårt labb använder primära neuronala råtta hippocampus kulturer för experimenten nedan. Följande beskriver den modifierade Bankiren protokoll för hur dessa cellkulturer skapas och upprätthålls. ⁹ Det finns naturligtvis skräddarsys en uttömmande antalet permutationer av dessa tekniker cellodling och eventuella etablerad metod för att de särskilda behoven hos en viss laboratorium som ger en genomgående friska leverans av celler skulle vara en lämplig ersättare.

1. Fem autoklaveras, rund, 12 mm täckglas placeras i en 35 mm skålen och täckta med 80 mikrogram / ml Poly-D-Lysin (MW 70-150,000) i boratbuffert O / N, sköljas med vatten (cellodling kvalitet), därefter belagt med 1 mikrogram / ml Laminin i boratbuffert O / N sköljas sedan på nytt med vatten. NG media (MEM med Earles salter och GlutaMAX kompletteras med glukos (0,6% w / v), penicillin (100 U / ml), streptomycin (100 mikrogram / ml), häst serum (10% v / v)) läggs till och rätter lagras i en inkubator (5% CO ₂ vid 37 ° C). Den PDL150/laminin fungerar som ett substrat för isolerade nervceller att växa på som en monolager. Den täckglas kan beläggas upp till två veckor innan plätering.
2. På dagen för plätering, är primära neuroner från embryonala dag 18 råtta hippocampi klädd i ng medierna genom att tillsätta 1,5 mL av en 100.000 celler / ml suspension. Fyra till sex timmar efter plätering är varje 35 mm maträtt som behandlas med 0,75 mikroliter av 5 mM cytosin beta-D-arabinofuranoside (ara-C) för att förhindra tillväxt av eventuella kontaminerande gliaceller. Tjugofyra timmar senare, är den plätering media ändrats till MEM med Earles salter och L-glutamin kompletterad med 0,6% w / v glukos, 1 mm natrium pyruvat och B27. Celler tillåts att växa i minst två veckor innan användning i alla experiment för att möjliggöra fullständig utveckling av processer.

2. Förbereda Pipetter

Anmärkning om RNaser: Huden, saliv och även andetag är stora källor till RNaser, enzymer som försämrar RNA. Det är viktigt att RNas-fri teknik observeras från och med nu i protokollet så att provet inte blir förorenat med RNaser och senare försämras. Detta inkluderar alltid handskar vid hantering av prover och reagenser, aldrig prata över prover eller reagens och använda nya lådor med steriliserade pipettspetsar och rör. Ofta är pipetter som inte är utsedda endast för RNA arbetet dekontamineras genom att torka dem med en RNas behandling lösning som RNas BORTA (molekylär Bioproducts). Men dessa lösningar hämma någon nedströms enzymatiska reaktioner så är det också viktigt att förhindra förorening av dina prover med dessa behandlingar.

1. Autoklav 1,5 mm ytterdiameter (OD) glaspipetter.
2. Med hjälp av en mikropipett avdragare, dra pipetter till en diameter lämpligt för elektrofysiologiska inspelningar, som kan variera beroende på avdragare, glödtråd, och pipetter. ¹⁰ hålstorlek är inte alltför kritisk eftersom spetsen kommer att brytas innan en cell samlingen.
3. Försiktigt lagra pipetter i en dammfri miljö där tips förblir intakt (helst använda en mikropipett lagring burk).
4. För att bryta spetsen på ett kontrollerat sätt, hålla en kimwipe spänt mellan fingrarna i ena handen och mycket försiktigt borsta toppen av pipetten över pappret 1 till 2 gånger. Öppningen bör vara ca 75-100% av målet cellstorlek. Justera detta steg tills du uppnår önskat resultat.

3. Förbereda Kultur, rör och Mikroskop

1. Förbered önskat antal 1,7 ml Eppendorf-rör. Tillsätt 2 mikroliter av PBS, första delen buffert om materialet ska användas för enskild cell förstärkningar eller någon annan lösning för lagring av det skördade materialet.
2. För skörd, behöver du en ljus mikroskop med en 40x objektiv utrustade med en mikromanipulator. Använd en pipett hållare med slangar som leder bort från hållaren. Fäst slangen till ett stabilt underlag för att förhindra oönskade rörelser av pipetten vid insamlingen. I slutet av slangen, sätt en nål så att en 1 ml spruta med en Luer-Lock-anslutning kan anslutas och ändras i mellan användare.
3. Om du använder täckglas, arbeta med ett täckglas i taget. Om nödvändigt, överföra en enda täckglas till en ny 35 mm maträtt * innehåller PBS eller media val. Ju längre cellerna ur inkubatorn, desto mer ohälsosam de kommer att bli och desto mer deras mRNA-profiler kommer att avvika från det av en frisk cell. Det är viktigt att bevara hälsan hos de celler på den andra täckglasen genom att hålla dem i inkubatorn när de inte arbetar med dem. Arbeta så snabbt som möjligt med celler utanför inkubatorn.

* Med vår inställning är det nödvändigt att använda locket på en 35 mm maträtt eftersom väggarna i själva skålen är för höga för att möjliggöra en verklig utveckling av mikropipett mot coverslis.

4. Skörd Celler

1. Säkra mikropipett i mikropipetten hållaren. Fäst mikropipett innehavaren att insatsen på micromanipulators. Ställ 40x målet.
2. Placera skålen på mikroskop scenen och hitta ett område av celler som lämpar sig för skörd. När det gäller primära neuronala kulturer ska cellen vara relativt isolerade från sina grannar för att förhindra att skörden av omgivande celler och / eller processer. Befolkningen i mRNA transkript mellan soma och processer varierar, så om intresserad av somatiska mRNA enbart skall försiktighet vidtas för att förhindra kontaminering av Soma med processer. Placera den cell du vill att skörda i mitten av synfältet.
3. Använd mikromanipulator att föra mikropipett mot lösningen i skålen in i ljusstrålen. Sänk pipettspetsen i lösningen. Applicera positivt tryck från denna punkt på genom att blåsa försiktigt genom sprutan. Titta genom okularet. Pipetten ska visas som en skugga i synfältet. Väl över planet av cellerna, justera placeringen av pipettspetsen tills det är inom synfältet och fokusera på pipettspetsen med grov fokusering rattarna. Vid det här laget bör det bedömas om hålstorlek av pipetten är för stort eller för litet. Öva skörd kommer att ge möjlighet att bestämma om rätt hålstorlek har uppnåtts vid denna tidpunkt.
4. Nu förväg pipetten mot plan celler. Det är viktigt att spetsen inte är avancerad alltför hastigt, vilket ledde till avbrott i den region som du vill samla in. För att förhindra detta använder de grova fokus att föra fokalplanet innan vidare pipettspetsen mot celler med micromanipulators. När du är nära till de celler, använder de fina fokus tills både celler och pipettspetsen är i fokus. Sluta tillämpa positivt tryck innan du når planet av cellerna för att förhindra att blåsa bort dem av täckglas.
5. Använd micromanipulators att placera pipettspetsen så att det är att röra cellen Soma du vill skörda.
6. Använd sprutan, försiktigt sug genom munnen tills cellen går in i pipettspetsen. Om cellen inte går in pipetten, rör försiktigt spetsen närmare cellen och nedåt tills det lyfter från täckglas.

5. Spara Cell

1. Använd mikromanipulator att omedelbart flytta pipetten upp och ut av lösningen.
2. Förflytta pipetten från hållaren.
3. Håll 1,7 ml Eppendorf-rör i ena handen och försiktigt bryta spetsen av pipetten på sidan av röret mot botten. (Sikta på 0,1 ml-markeringen.)
4. Med den trasiga spetsen centreras inuti röret, sätt en nål fäst vid en 1-3 ml spruta in i toppen öppnandet av pipetten. Snabbt tryck in kolven tvingar lösningen i pipetten att spruta ut i röret. Cellen bör förbli i själva toppen av pipetten och detta bör vara tillräcklig för att korrekt utvisa cellen. Var noga med att inte vidröra tips till någon vätska på sidorna av röret som kapillärkraften kommer låt vätskan tillbaka in i pipetten.
5. Snabbt spinn ner innehållet i röret med hjälp av en stationär mikrofugrör och omedelbart frysa (förvaras vid -80 ° C) eller placera på is för vidare bearbetning (att föredra).

6. ARNA Amplifiering

1. Omgång 1 Första programområdet cDNA syntes:
   Skapa mRNA / cDNA hybrider.
   1. För varje 5 mikroliter av en enda cell samling volym, lägga 1x av följande till samlingen röret (på is). Reaktionen kan skalas upp för större samling volymer (2x för 10 mikroliter samling volymer, etc.). Skapa en Master Mix genom att multiplicera följande reagenser med antalet Uppsamlingsrör plus 10-20% till svars för pipettering fel. Gör detta för varje efterföljande reaktion i ARNA ampification förfarande.
      • MED IS
      • 1,2 mikroliter dNTP s (2,5 mm vardera)
      • 2,4 mikroliter 5x Första programområdet buffert
      • 0,3 mikroliter T7-oligo (DT) grundfärg (100 ng / l)
      • 1,2 mikroliter DTT (100 mm)
   2. Ta upp volymen till 10,25 mikroliter med nukleas fritt vatten. Pipettera mix och snurra med hjälp av en kort stund en mikrofugrör.
   3. Inkubera 5 minuter vid 70 ° C för att denaturera någon sekundär struktur mRNA. Placera omedelbart på is i minst 5 minuter.
   4. Lägg till (igen med en Master Mix):
      • 0,3 mikroliter RNasin (40 U / l)
      • 0,45 mikroliter Upphöjd III (200 U / l)
      • 1 mikroliter nukleas fritt vatten
   5. Pipettera mix och spin kort. Inkubera 1 timme vid 42 ° C.
   6. Inkubera vid 70 ° C i 15 minuter för att inaktivera Upphöjd. Fortsätt till nästa steg.
2. Omgång 1 Andra programområdet cDNA syntes
   Skapa RNA primer från mRNA del av mRNA / DNA-hybrid till stöd i syntesen of dubbelsträngad cDNA.
   1. • MED IS
      • Till den 12 mikroliter första delen reaktion, lägg till:
      • 8 mikroliter nukleas fritt vatten
      • 7,5 mikroliter 5x Andra programområdet buffert
      • 0,75 mikroliter dNTP mix (2,5 mm vardera)
      • 0,25 mikroliter DNA-ligas (10 U / l)
      • 1 mikroliter DNA-polymeras I (10 U / l)
      • 0,25 mikroliter RNas H (2 U / l)
      Blanda noggrant genom att pipettera och snurra kort. Inkubera 2 timmar vid 16 ° C.
   2. Tillsätt: 1 mikroliter T4 DNA-polymeras (5 U / l). Blanda genom att pipettera och snurra kort. Inkubera 10 minuter vid 16 ° C.
   3. Städa upp reaktionen med Qiagen MinElute kit enligt tillverkarens anvisningar med smärre ändringar: ¹¹ Tvätta två gånger med 500 mikroliter tvättbuffert istället för en gång med 750 mikroliter. Eluera i nukleas fritt vatten.
   4. Koncentrera till 2-4 mikroliter med en Speedvac eller etanol nederbörd. För etanol nederbörd agerar glykogen som en nukleinsyra transportör och används när utlösande små mängder DNA eller RNA. Natrium från natriumacetat hjälper till att neutralisera den negativa laddningen av DNA ryggraden, medhjälp i nederbörd. Det är inte nödvändigt att göra en Master Mix för rutinmässig nederbörd.
      • Tillsätt 29 mikroliter DEPC vatten
      • 2 mikroliter glykogen (5mg/mL)
      • 1 / 10 volym (3 mikroliter) 3M Natriumacetat
      • 2,5 volymer (~ 250 mikroliter) kallt 100% etanol
      Blanda väl. Fällningen vid -80 ° C (30 min. Till O / N).
   5. Centrifugera i 20 minuter vid 4 ° C.
   6. Avlägsna supernatanten och tvätta pelleten med 800 mikroliter 70% etanol. Se till att dra loss pelleten antingen genom pipettering eller vortexa till hjälp vid avlägsnande av överflödigt salt.
   7. Centrifugera i ytterligare 20 minuter vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten och lufttorka i 15-20 minuter.
   8. Resuspendera i 4 ìl nukleas fritt vatten. Förvara vid -20 eller -80 ° C eller fortsätta vidare till nästa steg.
3. Omgång 1 In vitro transkription (IVT):
   Syntetisera antisense-RNA från T7 promotorn införlivas i strandsatta dubbla cDNA.
   1. Denna reaktion utförs med hjälp av Ambion MEGAscript T7 kit enligt tillverkarens anvisningar, utom skalas för en 10 mikroliter istället för en 20 mikroliter reaktion. Det är absolut nödvändigt att montera denna reaktion vid rumstemperatur och hålla bufferten i rumstemperatur under monteringen ^12. Den medföljande buffert fälls DNA om det är iskallt. Håll NTPs och enzymet mix på is när den inte används.
      • RUMSTEMPERATUR
      • Överför återsuspenderade dubbelsträngad cDNA till en tunnväggiga PCR-rör.
      • Tillsätt 4 mikroliter NTP-mix (18,75 mm vardera)
      • 1 mikroliter 10x reaktion buffert
      • 1 mikroliter 10x enzym blandning
   2. Inkubera 14 timmar vid 37 ° C i en termocykler (föredras) eller inkubator.
   3. Denna reaktion kan saneras med två olika metoder följt av koncentration av provet med en Speedvac eller etanol nederbörd. För sanering med hjälp av ett kit, gå vidare till Metod A. För städa upp med en standard fenol / kloroform utvinning, gå vidare till metod B.
   4. Metod A:
      1. Städa upp reaktionen med Ambion Megaclear kit enligt tillverkarens anvisningar med några ändringar ^13: Tvätta två gånger med 500 mikroliter tvättbuffert istället för en gång med 750 mikroliter. För eluering steget, tillsätt 50 mikroliter av nukleas fritt vatten till mitten av kolumnen, inkubera vid 70 ° C i 10 minuter. Spin vid 10000 g under 1 minut. Upprepa i en fräsch tub. Kombinera eluat. Koncentrera prov till 2-4 mikroliter med en Speedvac ELLER av etanol nederbörd.
      2. För etanol nederbörd: är Ammoniumacetat används i stället för natriumacetat i detta fall eftersom den är effektiv på att förebygga samfällning av fria nukleotider med nukleinsyra. Detta är viktigt på grund av den höga koncentrationen av NTP har använts i IVT reaktion, vilket kan hämma nedströms reaktioner.
         • Tillsätt 50 mikroliter DEPC vatten
         • 2 mikroliter glykogen (20 mg / ml)
         • 0,6 volymer (37,2 mikroliter) 5M Ammoniumacetat
         • 2,5 volymer (~ 180 mikroliter) kall etanol
      3. Fällningen vid -80 ° C (30 min. Till O / N) .*
      4. Centrifugera i 20 minuter vid 4 ° C.
      5. Avlägsna supernatanten och tvätta pelleten med 800 mikroliter 70% etanol (i nukleas fritt vatten). Se till att dra loss pelleten att ta bort allt överflödigt salt.
      6. Centrifugera i ytterligare 20 minuter vid 4 ° C.
      7. Avlägsna supernatanten och lufttorka 15-20 minuter.
      8. Resuspendera pelleten i 4 mikroliter nukleas fritt vatten.
   5. Metod B:
      1. Alternativt kan ARNA städas upp med en standard fenol / kloroform extraktion.
         • Tillsätt 50 mikroliter DEPC vatten
         • 2 mikroliter glykogen (20 mg / ml)
         • 0,6 volymer (37,2 mikroliter)5M Ammoniumacetat
         • 1-volym (98 mikroliter) Fenol: kloroform: Isoamyl alkohol 25:24:1 (jämvikt till pH 7,8-8,0)
      2. Vortexa i 15 sekunder. Centrifugera i 1,5 minuter vid halv maximal hastighet i en bordsskiva mikrocentrifug. Överför den övre vattenskiktet till ett nytt rör som innehåller 2,5 volymer (245 mikroliter) kallt etanol.
      3. Fällningen vid -80 ° C (30 min. Till O / N).
      4. Centrifugera i 20 minuter vid 4 ° C.
      5. Avlägsna supernatanten och tvätta pellets med 800 mikroliter 70% etanol (i nukleas fritt vatten). Se till att dra loss pelleten att ta bort allt överflödigt salt.
      6. Centrifugera i ytterligare 20 minuter vid 4 ° C.
      7. Avlägsna supernatanten och lufttorka 15-20 minuter.
      8. Resuspendera pelleten i 4 mikroliter nukleas fritt vatten.
         
         * Provet kan frysa vid denna temperatur under natten inkubationer. Det har visat sig att detta faktiskt kan öka utbytet av nukleinsyror.
4. Omgång 2 Första programområdet cDNA syntes
   1. • MED IS
      • Tillsätt 1 mikroliter Slump primers (0,05 mg / ml) *
   2. Värm vid 70 ° C i 10 minuter. Placera omedelbart på is i minst 5 minuter.
   3. • Tillsätt 2 mikroliter 5x Första programområdet buffert
      • 1 mikroliter DTT (100 mm)
      • 0,5 mikroliter dNTP s (2,5 mm vardera)
      • 0,5 mikroliter RNasin (40 U / l)
      • 1 mikroliter Upphöjd III (200 U / l)
   4. Blanda noggrant genom att pipettera och snurra kort. Låt sitta i rumstemperatur i 10 minuter. Detta steg krävs för att möjliggöra en förlängning av den korta slumpmässiga primers innan omvänd transkription reaktionen utförs.
   5. Inkubera i 30 minuter vid 42 ° C.
   6. Värm 5 minuter vid 95 ° C för att denaturera RNA i DNA / RNA-hybrider. Placera på is i minst 5 minuter. Förvara vid -20 ° C eller -80 ° C eller omedelbart vidare till nästa steg.
      
      * Koncentrationen av slumpmässiga grundfärg är viktig. Om koncentrationen är för hög, kommer produkten att vara mer trunkeras med varje omgång av förstärkning.
5. Omgång 2 Andra programområdet cDNA syntes
   1. • MED IS
      • Tillsätt 2 mikroliter T7-oligo (DT) primer (10 ng / l) *
   2. Värme i 5 minuter vid 70 ° C. Placera omedelbart på is i minst 5 minuter. Spin kort.
   3. • Lägg till 43,5 mikroliter nukleas fritt vatten
      • 15 mikroliter 5x Andra programområdet buffert
      • 1,5 mikroliter dNTP mix (2,5 mm vardera)
      • 2 mikroliter DNA-polymeras I (10 U / l)
   4. Blanda noggrant genom att pipettera och snurra kort. Inkubera 2 timmar vid 16 ° C.
   5. Tillsätt 2 mikroliter T4 DNA-polymeras (5 U / l)
   6. Blanda noggrant genom att pipettera och snurra kort. Inkubera 10 minuter vid 16 ° C.
   7. Städa upp reaktionen med Qiagen Minelute kit i avsnitt 6.2.3.
   8. Koncentrera till 2-4 mikroliter med en Speedvac eller etanol fällning som i avsnitt 6.2.4 till 6.2.8.
      
      * Notera de olika lager koncentrationen av T7-oligo (DT) primer jämfört med första omgången andra delen cDNA syntes.
6. Omgång 2 In vitro transkription
   Gör som i avsnitt 6.3.
   1. Upprepa avsnitt från 6,4 till 6,6 önskat antal gånger. Observera att varje efterföljande omgång av förstärkning ger kortare ARNA produkter. Antalet omgångar av förstärkning bör begränsas av detta skäl. Normalt, två till tre rundor av förstärkning är tillräckliga för att förstärka materialet skördas från en enda cell för att utföra microarray analys. Vid microarray analys, är den tredje omgången IVT reaktion utförs med hjälp av Illumina TotalPrep RNA amplifieringskit enligt tillverkarens anvisningar. Denna procedur innehåller biotin-märkt UTP i ARNA som sedan används för detektion på en microarray chip.
   2. Mäta koncentrationen av tredje omgången ARNA med en Nanodrop eller Agilent Bioanalyzer med en Nano RNA kit.

7. Representativa resultat

Lyckad skörd av en enda cell från primära neuronala kulturer kan fyllas i på mindre än 2 minuter, beroende på aptitude (se figur 1). Kommer dock dags för skörd varierar mellan system och med mellanliggande experimentell manipulation. Utsätta en enda cell till ARNA förfarandet (se figur 4A och 4B) resulterar i mikrogram mängder av totala förstärks ARNA och ger en karakteristisk bred topp när de analyseras med en bioanalyzer (se figur 3). Tre omgångar kan fyllas i minst tre dagar, vilket möjliggör snabb analys av en enda cell genuttryck.

Figur 1. Visas är ett exempel på en lyckad skörd av en isolerad neuron. Vi Selected en relativt låg densitet regionen (A) och avancerade pipettspetsen mot den önskade cellen (B). Den tredje bilden (C) visar synfältet efter att cellen hade skördats. Observera att de omgivande processerna kvar på täckglas.

Figur 2. Här visas två bilder av pipettspetsar, som är en olämplig storlek för effektiv avverkning. Dessa tips kommer att leda till ofullständig skörd (A) och skörd av omgivande miljö (B) respektive.

Figur 3. Efter skörd och förstärkning, analys med en bioanalyzer rekommenderas för att undersöka fördelningen och kvantitet förstärks RNA. En framgångsrik förstärkning från encelliga materialet kommer att ge sammanlagt belopp i låga mikrogram och kommer att ha en fördelning som är jämn och bred.

Siffror 4. Schema för den första omgången (A) och den andra omgången (B) i ARNA förfarandet visas.

Discussion

Anteckningar och felsökning

• Du kanske vill ta före och efter bilder som visar att målcellen var isolerat och att resterande Penumbra lämnades orörd.
• Om för mycket vätska kommer in i pipetten som du är skörd, kan du använda 3-vägs Luer-Lock kopplingar och kolven till sprutan för att hålla övertryck i slangen. Önskad volym varierar med typ av behandling, men upp till 5 l ska vara bra för de flesta tillämpningar.

Allmänna tips om molekylärbiologiska tekniker

• Vortex alla djur rör och spinn ner dem innan du lägger till en reaktion. ALDRIG virvel enzymer.
• Blanda reaktioner innan du lägger det enzym för att säkerställa att bufferten är i rätt koncentration.
• Håll enzym lager vid -20 ° C om möjligt med hjälp av en stratacooler. Annars ta höger före användning, hålla på is, och omedelbart återvända till -20 ° C.
• Gör alltid huvudmixar när de upprättat mer än en reaktion för att minska pipettering fel. Beräkna volymen som behövs baserat på det antal prover och lägga till 10-20%.
• Förvara RNA vid -80 ° C till fördröja nedbrytning. RNA är mest stabila lagras i bufferten för att fördröja apurination av RNA som sker i sur miljö.

Allmän beskrivning av ARNA arbetsordningen

Figur 4A visar den första rundan av ARNA förfarande. I den första delen reaktionen väljer poly-T delen av T7-oligo (DT) primer för mRNA-arter (långa vita rektangeln) genom att binda till Polya svansar. Vissa mikroRNA också polyadenylated och kommer att fångas av detta förfarande. Ännu viktigare är dock den vanligast förekommande RNA i cellen, ribosomala RNA, kommer inte. Detta oligo fungerar som en primer för omvänt transkriptas att syntetisera en kompletterande delen av cDNA (lång grå rektangel) med mRNA som mall. Den T7 delen av T7-oligo (DT) primer innefattar T7 RNA-polymeras promotor i ramen med sekvensen antisense till start mRNA. Detta används senare i in vitro transkription reaktion.

Därefter är det mRNA i mRNA / DNA-hybrid skapade i föregående steg delvis hydrolyserad genom RNase H skapa RNA "primer" (små vita rektanglar) liknande den Okazaki fragment som skapas i eftersläpande del DNA-syntesen. DNA-polymeras Jag använder RNA-fragment till bästa DNA-syntesen genom att använda DNA komplement till mRNA som mall. När den når nästa RNA fragmentet, dess 5 'till 3' nukleas aktivitet tar bort ribonucleotides och ersätter dem med deoxyribonucleotides. DNA-ligas läggs till ligate några trådar där utbyte av de ledande tråd är inte komplett. T4 DNA-polymeras tillsätts för att fylla i de områden där RNA-fragment tjänade som första primer till DNA-polymeras jag skapar en trubbig slutade dubbelsträngad cDNA som sedan renas innan du utför IVT reaktion.

I IVT reaktion binder T7 RNA-polymeras till T7 promotorn införlivas i dubbelsträngad cDNA och syntetiserar antisense-RNA-molekyler (långa svarta rektanglar) med hjälp av sense-strängen som mall. Detta fungerar som amplifieringssteg där tusentals antisense-RNA-molekyler produceras från varje dubbelsträngad cDNA molekyl (Figur 4A).

Den andra omgången, som avbildas i figur 4B, börjar med en omvänd transkription reaktion som skiljer sig något från den första omgången eftersom grundbeloppet RNA antisense (solid svart rektangel) och saknar polyadenylated svansen som var målgruppen för T7-oligo (DT) primer i första omgången. Därför är denna reaktion primas med slumpmässiga primers (små grå rektanglar) och RNA senare denatureras. Den andra delen reaktionen sedan grundmålas med T7-oligo (DT) primer, som binder till poly-En sekvens på 3 "i slutet av den meningen RNA som skapats i föregående omvänd transkription reaktion. En annan IVT Reaktionen utförs på samma sätt som i den första omgången. Denna andra runda är oftast upprepas minst en gång för att uppnå tre rundor av förstärkning från en enda cell.

Applikationer

De tekniker som vi har presenteras i denna artikel kan översättas till ett stort antal ansökningar. Den enda cell isolering protokoll kan modifieras för att användas i akuta skivor. ¹⁴ Även tekniskt mer utmanande, samma principer gäller i den här alternativa beredning. Dessutom, om storleken på pipetten är något justerad, kan inspelningar av fysiologi cellerna göras innan skörden möjliggör en väl kontrollerad undersökning av molekylära mekanismerna bakom fysiologiska utgångar. En annan liten ändring är att isolera processer från cellen soma. ¹⁵ För denna tillämpning samla cell kroppar med en pipett och sedan gå tillbaka med en fräsch pipett och samla 100-300 identifierade dendrites eller axoner per provröret. ¹⁶

När cellerna har skördats, jämförelser av mRNA abundances och kompositioner kan göras mellan olika och även inom samma cell populationer. Införliva biotinylerad-UTP i den tredje omgången ARNA möjliggör microarray analys för att fastställa dessa relativa mRNA abundances. Sammansättningen av den ursprungliga mRNA befolkningen kan också bestämmas efter ARNA proceduren med nästa generations sekvensering. Det förstärkta ARNA kan också användas för att bekräfta cellförsök fenotyp omvandling där en fullständig uppsättning mRNA från en cell typ transfekterade till en annan celltyp i syfte att förmå övergång fenotyp av den senare celltyp liksom i den förra, ett förfarande som utvecklats av labbet och kallas TIPeR. ¹⁷ Dessa studier är särskilt användbara för att studera sjukdomen stater och fenotyper cell och sådana studier pågår för närvarande i labbet. RT-PCR eller realtids-PCR kan utföras på det förstärkta materialet för att bekräfta ett uttryck för cell-specifika gener. Dessutom kan utvärderingar av effektiviteten i transfektion eller transduktion göras på enskild cellnivå.

Fördelar och begränsningar

Som framgår av abstrakt, eliminerar isolering av enskilda celler för analys i genomsnitt effekter setts med analys av heterogena cellpopulationer. Dessa genomsnitt effekter förvränga mRNA abundances i en enda cell med över-som representerar rikligt avskrifter och i genomsnitt ut och förhindra upptäckt av många låg-överflöd avskrifter. Flödescytometri kan användas för att sortera enskilda celler, men denna metod kräver kunskap om cellens specifika markörer och dyr utrustning. ¹⁸ Laser fånga microdissection antingen med UV-eller IR laser fånga microdissection system möjliggör enskild cell och även subcellulära fånga men kräver celler av intresse för placeras på ytan av mycket tunna sektioner. ¹⁹ Liknande flödescytometri kräver laser fånga microdissection också dyr utrustning.

En av de stora fördelarna med elektroden baserade samlingen teknik som beskrivs ovan är att värdefull elektrofysiologiska data kan erhållas från cellen av intresse före skörd, vilket möjliggör funktionell och transkriptom analys som ska utföras på en och samma cell. ²⁰ En nackdel med vår teknik är att det kräver erfarenhet av att använda micromanipulators. Utredarna känner micromanipulators finner denna teknik mycket intuitivt, men kommer personer utan sådan erfarenhet måste bli bekväm med erforderlig fina rörelser.

Naturlig del av varje förstärkningsteknik skall förmånssystemet förstärkning av vissa avskrifter baserade på storlek och nukleotid sammansättning. ^4,6,7 polymeraskedjereaktion (PCR) tekniker som omvänd transkription polymeraskedjereaktion (RT-PCR) och snabb förstärkning av cDNA ändar (RACE) resultera i exponentiell amplifiering av avskrifter, medan ARNA amplifieringsförfarande resulterar i linjär förstärkning. Således ligger en av de stora fördelarna med ARNA förfarandet i sin förmåga att bättre bevara den relativa förekomsten av mRNA transkript med endast linjärt förstärka eventuella fel eller fördomar som inträffar i amplifieringsprocessen i motsats till exponentiellt förstärka sa fel och fördomar.

Det ARNA förfarande i kombination med microarray analys möjliggör jämförelser av mRNA abundances mellan enskilda celler av liknande eller olika morfologi, behandlade eller obehandlade. Dessutom kan förstärkas material lämnas för nästa generations sekvensering. ^5,8 bör dock vara försiktig i sådana analyser sedan, i motsats till användningen av slumpmässiga grundfärg för förfarande, oligo-dT primas förfarande som beskrivs ovan fördomar amplifiering av 3 'änden av mRNA och leder i allmänhet liten förkortning av efterföljande förstärkt material med varje runda. Försiktighet bör iakttas vid analys av microarray resultat med standardiserade metoder som några falska frånvarande samtal kan uppstå kortas något förstärkt material. Dessutom kommer samtidigt sekvensering resultat att ge de fulla 5 "sekvens av de flesta av de ursprungliga mRNA, den 5" kan sekvenser av vissa mRNA missas. Av dessa skäl bör antalet omgångar av kompletteringar vara begränsad.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spiegelgas coverslips	Carolina Biological	63-3029
Nunc 35x10 mm culture dishes	Fisher Scientific	12-565-90
Water for cell culture	Lonza Inc.	17-724Q	For making solutions used for cell culture and rinsing coverslips
Poly-D-Lysine MW70-150K	Sigma-Aldrich	6407
Laminin, ultrapure	BD Biosciences	354239
Boric acid	Sigma-Aldrich	B0252
MEM with Earle’s salts and glutamax	Invitrogen	41090-101	For plating cells
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8769
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15140-122
Horse serum	Invitrogen	16050
Cytosine beta-D-arabinofuranoside	Sigma-Aldrich	C1768
MEM with Earle’s salts and L-glutamine	Invitrogen	11095-098	For growing cells
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256
B27 serum-free supplement	Invitrogen	17504-044
Borosilicate glass capillary tubes (1.5mm O.D, 100mm length)	Kimble Chase	34500 99	Any borosilicate glass pipette will work as long as the proper bore size is attained.
HBSS	Invitrogen	14175	Any solution will work as long as the components won’t interfere with any future processing (i.e. no Ca2+ or Mg2+)
1ml syringe	BD Biosciences	309628
Needle	BD Biosciences		Gauge depends on the diameter of the pipettes
dNTP mix	Amersham	28-4065-51
dt-T7 oligo	Custom	Midland Certified
Second strand buffer (5x)	Invitrogen	Y01129
DTT			Supplied with second strand buffer
E.coli DNA Ligase	Invitrogen	100002324
DNA polymerase I	Invitrogen	100004926
Rnase H	Invitrogen	18021-071
Megascript T7 kit	Ambion	AM1334
Random primers	BMB	11034731001
Superscript III Reverse Transcriptase	Invitrogen	56575	in kit (18080-044) comes with first strand buffer (Y02321) and DTT
MEGAclear Kit	Ambion	1908
MinElute Reaction Cleanup Kit	Qiagen	28206
T4 DNA polymerase	Invitrogen	100004994
Rnasin	Promega Corp.	N251B
Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit	Ambion	AMIL1791
Flaming/Brown micropipette puller	Sutter Instrument Co.	P-87	Sutter has many other models, many are discussed in the cookbook
Micromanipulator	Olympus Corporation		Many other micromanipulators will work such as the newer Eppendorf models
Pipette Holder	Warner Instruments	MP-S15A	Will vary with micromanipulator and pipette O.D.
Bioanalyzer RNA 6000 Nano Kit	Agilent Technologies	5067-1511