1. Objekt som behöver förberedas innan du fortsätter till Cell Plating: Lämplig volym av hela NSC mediet bereds genom att blanda NeuroCult NSC bassubstratets och NeuroCult NSC spridning Kosttillskott vid ett 9:1-förhållande, respektive. Ett delprov av NeuroCult NCFC serumfritt medium utan Cytokiner är tinade. Mediet värms upp i ett 37 ° C vattenbad. Stamlösningar av epidermal tillväxtfaktor (EGF), grundläggande fibroblastic tillväxtfaktor (B-FGF) vid koncentration av 10 mikrogram / ml och heparin på 0,2% är beredda framåt. Beroende på försöket storlek, finns flera 35mm vävnadskultur rätter som behövs för att platta cellerna och ett 150-200cm plast petriskål behövs också för att hålla dubbla 35mm rätter och en tredje 35mm skål för vatten. 2. Cellberedningen: Beroende på ditt experiment kan celler vara beredd från en vuxen eller embryonala källa (primär dissocierade vävnad eller dissocierade neurospheres). Dissekera vävnader från vuxna / embryonala mus centrala nervsystemet (CNS) eller separera vuxen / embryonala-derived neurospheres som beskrivits tidigare 1,2 och sedan: Den enda cellsuspension passerar genom en 40-ìm storlek filternät för att undanröja icke-differentierade klumpar. 10μl av cellsuspensionen blandas med 90μl av Trypan blått för att utföra ett celltal. OBS: Andra lämpliga cell spädningar kan också användas. Om du använder primära embryonala eller vuxna härrör neurala celler, späd cellsuspension till en koncentration på 6,5 x 10 5 celler / ml i fullständig NSC medium. Om du använder celler från dissocierade neurospheres från vuxna eller embryonala neurala celler, späd cellsuspension till en koncentration på 2,2 x 10 5 celler / ml i fullständig NSC medium. 3. Plätering Celler i Halvfast N-fiske Medium: En lämplig volym av följande komponenter blandas i ordning, beroende på antalet replikat. Här kan vi blanda den mängd som behövs för två replikat eller kopiera rätter. För ytterligare antal replikat, se tabell 1. 1,7 mL NeuroCult NCFC serumfritt medium utan cytokiner 330 mikroliter av NeuroCult NSC spridning Kosttillskott 6,6 mikroliter av EGF (10μg/mL) 32 mikroliter av Penicillin / streptomycin 3,3 mikroliter av B-FGF (10μg/mL) krävs endast om odling celler som härrör från vuxna neurala celler. 3,3 mikroliter av heparin (0,2%) krävs bara om odling celler som härrör från vuxna neurala celler. 25μL cellsuspension (av 2,2 x 10 5 celler / ml celler från dissocierade neurospheres eller 6,5 x 10 5 celler / ml primära celler från dissocierade CNS vävnad). OBS: Den sista cellen pläterade siffror bör vara ca 2500 celler per 35 mm kulturen maträtt för neurosphere härledda celler och 7500 celler per 35 mm kulturen maträtt för primära celler. I vissa fall har den sista cellen bordläggning densitet justeras genom att utföra ett experiment cell titrering. För statistiska analyser, bör det totala antalet kolonier detekteras efter 21 dagar av kultur vara inom intervallet minst 50 till 150 kolonier. Det medium som innehåller cellerna blandas försiktigt och sedan 1,3 ml kall Kollagen lösningen överförs till cellsuspension och blandas väl genom varsam pipettering att inte införa några bubblor. Den blandade lösningen lämnas ut till mitten av varje 35mm kultur skålen (~ 1,5 ml / fat) och disken är tippas försiktigt med en cirkelrörelse för att låta blandningen fördelas jämnt över ytan av skålen. . Ett duplikat 35 mm kultur rätter placeras i en 100 mm Petri platta. Locket på nya 35 mm maträtt är bort och det öppna fatet är också placeras i samma 100 mm petriskål. Sterilt vatten läggs till i detta öppna 35 mm maträtt att bibehålla optimal fuktighet under inkubationstiden. Square bioassay plattor (245 mm) används när mer replikera 35 mm rätter har inrättats. Återigen, omfattar 2 eller 3 öppna 35 mm rätter som innehåller sterilt vatten. Plattorna överförs till en inkubator inställd på 37 ° C, 5% CO2 och 95% luftfuktighet. Den kollagen stelnar genom att öka temperaturen och gelbildningen kommer att ske inom cirka en timme. De kulturer bör inte störas under denna tid. Odlade celler inkuberas i 21 dagar (skillnader i kolonin storlek kan klart skiljas efter 21 dagar). 4. Förbereda Påfyllnad Medium och mata kultur: Som N-fiske kulturerna inkuberas under en längre tid (21 dagar) bör kulturer matas med rätt komplett NeuroCult påfyllning medelstora beredas på nytt enligt följande: 4,5 mL NeuroCult NSC bassubstratets blandas med 0,5 mL i NeuroCult NSC spridning Tillägg och sedan tillväxtfaktorer läggas till: 250 mikroliter av 10μg/mL fonden (för att ge en slutlig koncentration av 0,5 mikrogram / ml EGF) 125 mikroliter av 10μg/mL b-FGF (för att ge en slutlig koncentration av 0.25μg/mL b-FGF) krävs bara om odling celler som härrör från vuxna neurala celler. 125 mikroliter på 0,2% Heparin, krävs bara om odling celler som härrör från vuxna neurala celler. 60 mikroliter av lämplig kompletta NeuroCult Påfyllnad Medium (för embryonala eller vuxna celler) läggs in i mitten av varje NCFC analys maträtt en gång per 7 dagar under hela NCFC analys kultur inkubation (21 dagar). 5. Scoring N-CFC-analys Derived kolonierna och beräkna frekvensen av bona fide NSCs och neurala progenitorceller: Varje 35 mm kulturen skålen är placerad på en inrutade poäng rätt med nätet storlek på 2,0 mm x 2,0 mm och sedan båda skålarna är placerade på mikroskop scenen. Med låg effekt (2,5 X – 5X) objektiv, varje rätt skannas och kolonierna poängsätts utifrån deras storlek. Kolonier indelas i två huvudkategorier: Mindre än 2 mm i diameter ≥ 2 mm i diameter 6. Representativa resultat: Som i neurosphere analys, celler klädd i N-CFC-analysen börja föröka sig och göra små kolonier av celler inom 3 – 7 dagar efter bordläggning (figur 1). Om två veckor, kan kolonier av olika storlekar urskiljas. Medan majoriteten av kolonierna tenderar att sluta växa efter 14 dagar, några kolonier fortsätter att öka i storlek. På dagen 21, kan kolonier delas in i ett av de fyra kategorier: 1) mindre än 0,5 mm i diameter, 2) 0,5 – 1 mm diameter, 3) 1 – 2 mm diameter och 4) ≥ 2 mm i diameter. I praktiken är kolonier mindre än 2 mm i diameter kallas stamceller härstammar (Figur 2) och kolonier ≥ 2 mm i diameter kallas för NSC härrör (Figur 3). Antalet kolonier ≥ 2 mm i diameter per total celler pläterade, representerar frekvensen av den faktiska bona fide neurala stamceller med långsiktiga självförnyelse och flera potentiella kapacitet. Den totala neurosphere bildar frekvens i en viss cell population efter 7-8 dygn i en parallell NSA experiment har uppskattats att likna den totala kolonibildande frekvensen av samma cell population efter 21 dagar i en N-fiske experiment. N-fiske men ger en mer tillåtande skick så att varje cell kan visa sin fulla proliferativ potential. Komponent 2 replikat 3 replikat 4 replikat NeuroCult NCFC serumfritt medium utan cytokiner 1700 2550 3400 NeuroCult NSC spridning Kosttillskott 330 495 660 EGF (10 mikrogram / ml) 6,6 9,9 13,2 bFGF (10 mikrogram / ml), endast för vuxna celler 3,3 4,95 6,6 Heparin-lösning (0,2%), endast för vuxna celler 3,3 4,95 6,6 Penicillin / streptomycin (1:100) 32 48 64 Celler på: 2,2 x 10 5 odlade celler / ml eller 6,5 x 10 5 primära celler / ml 25 37,5 50 Kollagen Lösning 1300 1950 2600 Tabell 1. Komponenter av kompletta N-CFC analys kultur. Figur 1. Representant kolonier i N-fiske kultur passage en E14 mus NSCs 7 dagar efter plätering. Kolonierna kan visa olika morfologi och storlek. Original förstoring, 4x Figur 2. Representant föregångare härrör kolonier av olika storlekar i N-fiske kultur passage en E14 mus NSCs 21 dagar efter plätering. Som framgår, kolonierna har olika morfologi men alla är mindre 2 mm i storlek. Original förstoring, 4x Figur 3. Representant bona fide stamceller härstammar koloni i N-fiske kultur passage en E14 mus NSCs 21 dagar efter plätering. Stamceller härstammar kolonier kan visa olika morfologi (sevideon) men alla är ≥ 2 mm i diameter. Original förstoring, 4x