Summary
Este protocolo de vídeo se muestra cómo se discrimina y enumerar bona fide las células madre neurales en una población mixta de células precursoras neurales con el neuronales formadoras de colonias de células de ensayo.
Abstract
El ensayo neuroesfera (NSA) es uno de los métodos más utilizados para aislar, expandir y también calcular la frecuencia de las células madre neurales (NSC). Además, este sistema de cultivo libre de suero también se ha empleado para expandir las células madre y determinar su frecuencia a partir de una variedad de tumores y tejidos normales. Se ha demostrado recientemente que una relación de uno a uno, no existe entre la formación y neuroesfera NSCs. Esto sugiere que la NSA como se aplica actualmente, sobreestima la frecuencia de los comités directivos en una población mixta de células precursoras neurales aisladas, tanto del cerebro de los mamíferos embrionarias y adultas. Este vídeo demuestra un colágeno prácticamente novela basada semi-sólido ensayo, la neuro-formadoras de colonias ensayo de células (N-ACCP), que tiene la capacidad de discriminar se derivan de las células progenitoras en base a su potencial a largo plazo de proliferación, y por lo tanto proporciona un método para enumerar frecuencia NSC. En la N-CFCA, colonias ≥ 2 mm de diámetro se derivan de las células que cumplen todos los criterios funcionales de un Consejo de Seguridad Nacional, mientras que las colonias <2 mm se derivan de los progenitores. El procedimiento de N-CFCA se puede utilizar para las células preparadas a partir de diferentes fuentes, incluyendo adultos primaria y cultivadas, las células embrionarias de ratón del SNC. Aquí se utilizan las células preparadas a partir de un pasaje neuroesferas generadas a partir del día 14 embrionario del cerebro para llevar a cabo los ratones N-CFCA. Los cultivos se repone con el medio de la proliferación de cada siete días durante tres semanas para permitir que las células chapada a exhibir su potencial proliferativo completo y luego la frecuencia de las progenitoras neurales y de buena fe las células madre neurales se calcula, respectivamente, contando el número de colonias que son <2 mm y los que son ≥ 2 mm en referencia al número de células que se cultivaron inicialmente.
Protocol
1. Elementos que deben estar preparados antes de proceder a la chapa del celular:
- Volumen apropiado de medio completo NSC se prepara mezclando NeuroCult NSC medio basal y NeuroCult Suplementos NSC proliferación en una proporción de 9:1, respectivamente.
- Una alícuota de NeuroCult NCFC medio libre de suero sin citoquinas se descongela.
- El medio es calentado en un baño de agua a 37 ° C.
- Disponibilidad de soluciones de factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos (b-FGF) en la concentración de 10 mg / ml y heparina en el 0,2% son preparados con anticipación.
- Dependiendo del tamaño del experimento, varios platos de 35 mm de cultivo de tejidos son necesarios para la placa de las células y un 150-200cm placa Petri de plástico también es necesaria para mantener los platos de 35 mm y un duplicado tercer plato de 35 mm de agua.
2. Preparación de células:
Dependiendo de su experimento, las células pueden ser preparados a partir de una fuente de adultas o embrionarias (tejido primario disociados o neuroesferas disociadas). Diseccionar los tejidos de adultos / embriones de ratón del sistema nervioso central (SNC) o disociar neuroesferas adulto / embriones derivados de 1,2 como se describió anteriormente y luego:
- La suspensión de células individuales se hace pasar por un filtro de malla de 40 micras de tamaño con el fin de expulsar a los no disociados grupos.
- 10μl de la suspensión celular se mezcla con 90μl de azul tripán para llevar a cabo un recuento de células. Nota: Otros diluciones adecuadas de células también puede ser utilizado.
- Si se utiliza embrionarias o adultas derivadas primaria las células nerviosas, diluir la suspensión celular a una concentración de 6,5 x 10 5 células / ml en medio completo NSC. Si utiliza las células de neuroesferas disociadas derivados de las células neuronales adultas o embrionarias, se diluye la suspensión celular a una concentración de 2,2 x 10 5 células / ml en medio completo NSC.
3. Las células siembra en semi-sólida N-CFCA Medio:
- El volumen adecuado de los siguientes componentes se mezcla con el fin, según el número de repeticiones. Aquí se mezcla la cantidad necesaria para dos réplicas o duplicados platos. Para los números de repeticiones adicionales, por favor consulte la tabla 1.
- 1,7 ml de NeuroCult NCFC medio libre de suero sin citoquinas
- 330 L de NeuroCult NSC Suplementos proliferación
- 6,6 l de EGF (10μg/mL)
- 32 l de penicilina / estreptomicina
- 3,3 L de b-FGF (10μg/mL) sólo es necesario si el cultivo de células derivadas de células adultas neural.
- 3,3 l de heparina (0,2%) sólo es necesario si el cultivo de células derivadas de células adultas neural.
- 25μL de suspensión celular (de 2,2 x 10 5 células / ml de células de neuroesferas disociadas o 6,5 x 10 5 células / ml células primarias de tejido del SNC disociado). Nota: El número final de células plateado debe ser alrededor de 2500 células por 35 mm placa de cultivo para neuroesfera células derivadas y 7500 células por placa de cultivo de 35 mm de células primarias. En algunos casos, la densidad celular revestimiento final tiene que ser ajustado mediante la realización de un experimento de valoración de la célula. Para el análisis estadístico, el número total de colonias detectadas tras 21 días de la cultura debe estar dentro del rango de al menos 50 a 150 colonias.
- El medio que contiene las células se mezcla suavemente y luego 1,3 ml de la solución de colágeno frío se transfiere a la suspensión celular y se mezcla bien con la pipeta suave para evitar la introducción de las burbujas.
- La solución mezclada se imparte en el centro de cada plato de cultivo de 35 mm (alrededor de 1,5 ml / placa) y los platos se inclinan suavemente con un movimiento circular para que la mezcla uniformemente a lo largo de la superficie del plato. .
- El duplicado placas de 35 mm de la cultura se colocan en una placa de Petri de 100 mm. La tapa del nuevo plato de 35 mm se elimina y el plato abierto también se coloca en el mismo 100 mm placa de Petri. Agua estéril se añade a este plato mm abrir 35 para mantener la humedad óptima durante el período de incubación. Placas cuadradas bioensayo (245 mm) se utilizan cuando se replican más placas de 35 mm se han establecido. Una vez más, son 2 o 3 abrir placas de 35 mm que contiene agua estéril.
- Las placas se trasladan a una incubadora a 37 ° C, 5% CO2 y 95% de humedad. El colágeno se congela por aumento de la temperatura y la formación de gel se producirá dentro de aproximadamente una hora. Las culturas no debe ser alterada durante este tiempo.
- Cultivos de células se incuban durante 21 días (las diferencias en tamaño de la colonia se pueden distinguir claramente después de 21 días).
4. Preparación de medio de refuerzo y de alimentación de la Cultura:
Como la N-CFCA cultivos se incuban durante un período prolongado de tiempo (21 días), los cultivos deben ser alimentados con la NeuroCult completa adecuada medio reposición recién preparada de la siguiente manera:
- 4,5 ml de medio NeuroCult NSC basal se mezcla con 0,5 mL de NeuroCult NSC Suplementos proliferación y los factores de crecimiento se añade:
- 250 L de 10μg/mL EGF (para dar una concentración final de 0,5 mg / ml FEAG)
- 125 L de 10μg/mL b-FGF (para dar una concentración final de 0.25μg/mL b-FGF) sólo es necesario si el cultivo de células derivadas de células adultas neural.
- 125 l de 0,2% con heparina, sólo es necesario si el cultivo de células derivadas de células adultas neural.
- 60 L de la adecuada reposición NeuroCult medio completo (para que las células embrionarias o adultas), se añade en el centro de cada plato de ensayo NCFC una vez cada 7 días durante toda la incubación NCFC cultura de ensayo (21 días).
5. Anotando N-CFC colonias Ensayo derivados y calcular la frecuencia de bona fide NSCs y células progenitoras neurales:
- Cada plato de 35 mm cultura se coloca en un plato de puntuación cuadriculada con el tamaño de la malla de 2,0 mm x 2,0 mm y luego los dos platos se colocan en la platina del microscopio.
- El uso de baja potencia (2,5 veces - 5 veces) de objetivo, cada plato se escanea y las colonias se califican en función de su tamaño.
- Las colonias se clasifican en dos categorías principales:
- Menos de 2 mm de diámetro
- ≥ 2 mm de diámetro
6. Los resultados representativos:
Como en el ensayo neuroesfera, las células se sembraron en la N-CFC ensayo comienzan a proliferar y hacer pequeñas colonias de células dentro de 3 a 7 días después de placas (Figura 1). Dentro de dos semanas, las colonias de diferentes tamaños se pueden distinguir. Mientras que la mayoría de las colonias tienden a dejar de crecer después de 14 días, algunas colonias siguen aumentando de tamaño. El día 21, las colonias se pueden clasificar en una de las cuatro categorías: 1) menos de 0,5 mm de diámetro, 2) 0.5 a 1 mm de diámetro, 3) 1 - 2 mm de diámetro y 4) ≥ 2 mm de diámetro. En la práctica, las colonias más pequeñas que el diámetro de 2 mm se les conoce como progenitoras derivadas (Figura 2) y las colonias ≥ 2 mm de diámetro se conoce como NSC derivados (Figura 3). El número de colonias ≥ 2 mm de diámetro por las células chapada total, representa la frecuencia real de la buena fe, las células madre neurales a largo plazo la auto-renovación y capacidad de múltiples posibilidades. El total de la formación de neuroesfera frecuencia en una población de células en particular después de 7-8 días en un experimento paralelo NSA ha estimado que es similar a la colonia de la formación total de la frecuencia de la misma población celular después de 21 días en un experimento de N-CFCA. La N-CFCA sin embargo, constituye un requisito más permisivas a fin de cada celda puede mostrar su potencial proliferativo completo.
| Componente | 2 repeticiones | 3 repeticiones | 4 repeticiones |
| NeuroCult NCFC medio libre de suero sin citoquinas | 1700 | 2550 | 3400 |
| NeuroCult NSC proliferación Suplementos | 330 | 495 | 660 |
| EGF (10 mg / mL) | 6.6 | 9.9 | 13.2 |
| bFGF (10 mg / mL), sólo para las células adultas | 3.3 | 4.95 | 6.6 |
| Solución de heparina (0,2%), sólo para las células adultas | 3.3 | 4.95 | 6.6 |
| Penicilina / estreptomicina (1:100) | 32 | 48 | 64 |
| Las células en: 2,2 x 10 5 células en cultivo / ml o 6,5 x 10 5 células primarias / mL | 25 | 37.5 | 50 |
| Solución de colágeno | 1300 | 1950 | 2600 |
Tabla 1. Componentes de la cultura completa del ensayo N-CFC.
Figura 1. Colonias Representante de la N-CFCA cultura de NSCs paso del ratón E14 7 días después de la siembra. Las colonias pueden mostrar diferente morfología y tamaño. Original de la ampliación; 4x
Figura 2. Representante colonias progenitoras derivadas de diferentes tamaños en la N-CFCA cultura de paso un E14 NSCs ratón 21 días después de la siembra. Como se ve, las colonias tienen una morfología diferente, pero todos están menos 2 mm de tamaño. Original de la ampliación; 4x
Representante de la figura 3. Celular de buena fe, madre derivadas de colonias en la N-CFCA cultura de paso un E14 NSCs ratón 21 días después de la siembra. Colonias de células madre derivadas puede mostrar morfología diferente (verel video), pero todos son ≥ 2 mm de diámetro. Original de la ampliación; 4x
Discussion
A pesar de ensayo neuroesfera 3,1,2 es el método más común para aislar y expandir las células madre neurales de una variedad de fuentes como el tejido del SNC adultas y embrionarias, que no puede medir con precisión la frecuencia de NSC en una población mixta de células precursoras neuronales (tallo y progenitores), ya que no es una relación uno a uno entre el número de neuroesferas y el número de bona fide células madre 4. Para hacer frente a esta limitación, el original NSA ha sido adaptado para permitir la madre neuronales y progenitores para alcanzar su plena capacidad de proliferación durante tres semanas 5-7. A diferencia de los líquidos de la NSA, en la N-CFCA las colonias son en realidad clones derivados, como la matriz de colágeno semi-sólida que previene la migración de las células de una sola placa y la agregación de las colonias. Para obtener resultados consistentes con esta prueba se recomienda:
- Garantizar una única suspensión de células en la suspensión celular original. Pase su única suspensión de células a través de un filtro de malla de 40 micras de tamaño con el fin de expulsar a los no disociados grupos.
- Mantenga la solución de colágeno en el hielo o en la 4 ° C nevera. El colágeno es el último elemento que se añade a la mezcla de la suspensión celular, ya que se congela por el aumento de la temperatura.
- No te olvides de alimentar a la cultura de cada semana. Añadiendo el medio que contiene la reposición del factor de crecimiento (s) una vez cada 7 días permitirá que las células que siguen proliferando en el período de cultivo extendido.
- La densidad celular final de placas han sido optimizados para las células derivadas de cualquiera de las células neuronales primarias o cultivadas de modo que el número total de colonias detectadas tras 21 días de la cultura en el NCFC-A está dentro del rango de al menos 50 a 200 colonias. Esta gama permite la detección de las pocas colonias NSC derivados> 2 mm de diámetro en las muestras de tiempo que proporciona un número suficiente de colonias en los análisis estadísticos. Dependiendo de la fuente de células de partida, un número significativamente menor (<50) y un mayor número de colonias (> 250) a veces se obtienen. Colonias muy pocos se traducirá en las colonias> 2 mm de diámetro que debajo de los niveles de detección, mientras que las colonias también se traducirá en muchos anddepletion hacinamiento de los componentes del medio de cultivo que resulta en un recuento de colonias inexacta. Por lo tanto la densidad de recubrimiento celular tendrá que ser ajustado en consecuencia (es decir, aumentando o disminuyendo el número total de células sembradas)
Disclosures
Uno de los autores, Luis A. Sharon, está afiliada a StemCell Technologies Inc, fabricante de algunos reactivos utilizados en este estudio.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por fondos de la Fundación Overstreet.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| NeuroCult NCFC medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05720 | |
| 0.05% trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Biosciences | 352340 | |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| Collagen | Reagent | Stem Cell Technologies | 04902 | |
| EGF | Growth factor | R&D Systems | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D Systems | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352070 | |
| 35 mm culture dishes | Culture ware | Stem Cell Technologies | 27100 | |
| Gridded scoring dishes | Culture ware | Stem Cell Technologies | 27500 |
References
- Azari, H., Rahaman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J Vis Exp. , (2010).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahaman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. J Vis Exp. , (2011).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Louis, S. A. Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony Forming Cell Assay. Stem Cells. , (2008).
- Golmohammadi, M. G. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26, 979-987 (2008).
- Louis, S. A., Reynolds, B. A. Neurosphere and Neural Colony-Forming Cell Assays. Protocols for Neural Cell Culture. 10, 1-28 (2010).
