Summary
هذا البروتوكول فيديو يوضح كيفية تميز بحسن نية وتعداد الخلايا الجذعية العصبية في يسكنها خليط من الخلايا العصبية باستخدام السلائف فحص الخلايا العصبية المكونة للمستعمرة.
Abstract
في مقايسة neurosphere (NSA) هي واحدة من أكثر الوسائل استخداما لعزل وتوسيع وأيضا حساب تواتر من الخلايا الجذعية العصبية (NSCs). علاوة على ذلك ، كما تم هذا النظام ثقافة خالية من المصل المستخدمة لتوسيع تحديد الخلايا الجذعية وتواترها من مجموعة متنوعة من الأورام والأنسجة الطبيعية. فقد تبين مؤخرا أن هناك علاقة واحد الى واحد غير موجود وبين تشكيل neurosphere NSCs. هذا يشير إلى أن وكالة الأمن القومي كما هو مطبق حاليا ، يغالي في تواتر NSCs في يسكنها خليط من الخلايا العصبية السلائف معزولة عن كل من المخ الجنينية لدى الثدييات وتعليم الكبار. هذا الفيديو يوضح عمليا الكولاجين رواية تقوم شبه صلبة مقايسة ، والعصبية مستعمرة تشكيل خلية مقايسة (N - CFCA) ، والذي لديه القدرة على تمييز الخلايا الجذعية من السلف على أساس المحتملة على المدى الطويل التكاثري ، وبالتالي يوفر طريقة تعداد تردد مجلس الأمن القومي. في N - CFCA ، تستمد المستعمرات ≥ 2 مم وقطرها من الخلايا التي تفي بجميع المعايير الفنية لمجلس الأمن القومي ، في حين يتم اشتقاق المستعمرات <2mm ومن الأسلاف. ويمكن استخدام هذا الإجراء N - CFCA لخلايا المعدة من مصادر مختلفة بما في ذلك الكبار الابتدائي والمثقف أو الخلايا الجنينية الماوس الجهاز العصبي المركزي. هنا نستخدم خلايا المعدة من إحدى الفقرات neurospheres المتولدة من يوم 14 الفئران الجنينية لأداء الدماغ N - CFCA. وتتجدد مع ثقافات المتوسط انتشار كل سبعة أيام لمدة ثلاثة أسابيع للسماح للخلايا مطلي لعرض إمكاناتها التكاثري كامل ثم يتم حساب تواتر السلف العصبية وحسن النية الخلايا الجذعية العصبية على التوالي عن طريق حساب عدد المستعمرات التي هي <2mm و وتلك التي هي 2mm و≥ في اشارة الى عدد من الخلايا التي كانت مطلية في البداية.
Protocol
1. البنود التي تحتاج إلى تحضير قبل الانتقال إلى خلية التصفيحات :
- مستعدة المتوسطة الحجم المناسب لمجلس الأمن القومي الشامل ، عن طريق المزج NeuroCult NSC بصل متوسطة والمكملات NeuroCult انتشار NSC بنسبة 9:1 ، على التوالي.
- هو إذابة وقسامة من متوسطة NeuroCult المصل خالية NCFC دون السيتوكينات.
- وارتفعت درجة حرارة تصل في المتوسط في حمام ماء C ° 37.
- وتعد حلول المخزون من عامل نمو البشرة (EGF) ، عامل النمو الأساسي ليفية (B - FGF) في تركيز 10 ميكروغرام / مل والهيبارين عند 0.2 ٪ في المستقبل.
- اعتمادا على حجم التجربة ، هناك حاجة لعدة أطباق زراعة الأنسجة 35mm إلى الخلايا لوحة وهناك حاجة أيضا واحدة طبق بيتري 150 - 200cm البلاستيك لاجراء الأطباق مكررة 35mm وطبق third 35mm للمياه.
2. خلية التحضير :
اعتمادا على التجربة الخاصة بك ، يمكن أن تكون على استعداد خلايا من مصدر أخلاقي أو الجنينية (النسيج الأساسي أو فصلها neurospheres فصلها). تشريح الأنسجة من الكبار / الماوس الجهاز العصبي المركزي الجنينية (CNS) ، أو فصل neurospheres الكبار / الجنينية المستمدة من قبل كما هو موضح 1،2 ثم :
- يتم تمرير تعليق خلية واحدة من خلال شبكة تصفية 40 ميكرون الحجم وذلك لإزالة كتل غير فصلها.
- يتم خلط 10μl لتعليق الخلية مع 90μl التريبان الأزرق لإجراء تعداد خلايا ملاحظة : يمكن أيضا اخرى التخفيفات الخلية المناسبة يتم استخدامها.
- إذا باستخدام الجنينية الأولية أو الكبار الخلايا العصبية المشتقة منها ، تمييع تعليق خلية إلى تركيز 6.5 × 5 10 خلايا / مل في المتوسط NSC كاملة. إذا باستخدام خلايا من neurospheres نأت المستمدة من الخلايا العصبية الجنينية أو أخلاقي ، تمييع تعليق خلية إلى تركيز 2.2 X 5 10 خلايا / مل في المتوسط NSC كاملة.
3. الطلاء في خلايا متوسطة N - CFCA شبه الصلبة :
- خلط حجم مناسب من المكونات التالية بالترتيب ، اعتمادا على عدد من يعيد. نحن هنا مزيج المبلغ اللازم لمدة متماثلة أو مكررة الأطباق. لأعداد إضافية من يعيد ، يرجى الرجوع إلى الجدول 1.
- 1.7 مل من مصل NeuroCult متوسطة خالية NCFC دون السيتوكينات
- 330 ميكرولتر ملاحق NeuroCult انتشار NSC
- 6.6 ميكرولتر من EGF (10μg/mL)
- 32 ميكرولتر من البنسلين / الستربتوميسين
- مطلوب ب 3.3 ميكرولتر من جمعية جيل المستقبل ، (10μg/mL) إلا إذا استنبات الخلايا المشتقة من الخلايا العصبية للبالغين.
- مطلوب 3.3 ميكرولتر من الهيبارين (0.2 ٪) فقط إذا زرع الخلايا المشتقة من الخلايا العصبية للبالغين.
- 25μL التعليق الخلية (الخلايا من 2.2 × 5 / 10 مل من الخلايا neurospheres فصلها أو 6.5 × 10 الخلايا / 5 مل من الخلايا الأولية أنسجة الجهاز العصبي المركزي فصلها) ملاحظة : يجب أن الأرقام النهائية الخلية مطلي يكون حوالي 2500 خلية لكل 35 مم طبق الثقافة لneurosphere الخلايا المشتقة والخلايا 7500 بنسبة 35 ملم لصحن الثقافة الخلايا الأولية. في بعض الحالات ، والطلاء النهائية كثافة الخلية لابد من تعديلها من خلال إجراء تجربة معايرة الخلية. للتحليلات الإحصائية ، وينبغي أن العدد الكلي للمستعمرات اكتشافها بعد 21 يوما من ثقافة تكون ضمن مدى لا يقل عن 50-150 المستعمرات.
- خلط المتوسط تحتوي على خلايا بلطف ثم يتم نقل 1.3 مل من محلول الكولاجين الباردة إلى تعليق الخلية ويمزج جيدا بواسطة pipetting طيف لتجنب إدخال أي فقاعات.
- الحل هو الاستغناء مختلطة لمركز كل صحن الثقافة 35mm (~ 1،5 مل / صحن) ويتم ترجيح كفة باستخدام الأطباق بلطف بحركة دائرية على السماح للخليط موزعة بالتساوي على سطح الطبق. .
- توضع مكررة الثقافة 35 ملم في أطباق بتري ملم لوحة 100. تتم إزالة غطاء صحن جديد 35 مم ويوضع طبق أيضا مفتوحة في نفس طبق بيتري 100 ملم. يضاف الماء المعقم لهذا الطبق فتح 35 ملم للحفاظ على الرطوبة الأمثل خلال فترة الحضانة. تستخدم لوحات الأحيائي مربع (245 ملم) عندما تم تعيين أكثر الأطباق تكرار 35 ملم يصل. مرة أخرى ، وتشمل 2 أو 3 مفتوح 35 ملم الأطباق التي تحتوي على الماء المعقم.
- يتم نقل لوحات لمجموعة الحاضنة عند 37 درجة مئوية ، و 5 ٪ CO2 والرطوبة 95 ٪. سوف congeals الكولاجين بواسطة زيادة درجة الحرارة وتشكيل هلام تحدث في غضون ساعة واحدة تقريبا. لا ينبغي ان ينزعج الثقافات خلال هذا الوقت.
- يتم تحضين الخلايا المستنبتة لمدة 21 يوما (يمكن أن تكون هناك اختلافات في حجم مستعمرة التمييز بوضوح بعد 21 يوما).
4. إعداد متوسطة التجديد وتغذية الثقافة :
كما يتم تحضين N - CFCA الثقافات لفترة ممتدة من الزمن (21 يوما) ، يجب أن يكون الطعام مع الثقافات NeuroCult الكامل المناسبة أعد المتوسطة التجديد جديدة على النحو التالي :
- يتم خلط 4.5 مل من متوسطة NSC NeuroCult بصل مع 0.5 متريضاف L ملاحق NeuroCult انتشار NSC ثم عوامل النمو :
- 250 ميكرولتر من EGF 10μg/mL (لإعطاء تركيز النهائي من 0.5 ميكروغرام / مل EGF)
- المطلوب 125 ميكرولتر من 10μg/mL ب FGF - (لإعطاء تركيز النهائي من 0.25μg/mL ب FGF -) إلا إذا زرع الخلايا المشتقة من الخلايا العصبية للبالغين.
- 125 ميكرولتر من الهيبارين بنسبة 0.2 ٪ ، إلا إذا كان المطلوب زراعة الخلايا المشتقة من الخلايا العصبية للبالغين.
- يضاف 60 ميكرولتر من المناسب استكمال NeuroCult متوسطة التجديد (للخلايا الجنينية أو الكبار) في مركز كل طبق NCFC الفحص مرة كل 7 أيام خلال الفحص كامل NCFC حضانة الثقافة (21 يوما).
5. سجل المستعمرات الفحص N - CFC المشتقة وحساب تواتر NSCs حسن النية والخلايا العصبية السلف :
- يتم وضع كل ثقافة 35 مم طبق على طبق التهديف الموزعة مع حجم الشبكة ملم 2.0 ملم 2.0 x و ثم يتم وضعها كل من الاطباق على المسرح المجهر.
- تستخدم طاقة منخفضة (2.5X -- 5X) هدف العدسة ، يتم تفحص كل طبق وسجل المستعمرات القائمة على أحجامها.
- تصنف مستعمرات في فئتين رئيسيتين :
- أقل من 2 ملم القطر
- ≥ 2 مم
6. ممثل النتائج :
كما هو الحال في مقايسة neurosphere ، مطلي في الخلايا N - CFC مقايسة تبدأ تتكاثر وجعل مستعمرات صغيرة من الخلايا في غضون 3 -- 7 أيام بعد الطلاء (الشكل 1). في غضون اسبوعين ، يمكن التمييز بين المستعمرات من أحجام مختلفة. في حين أن الغالبية العظمى من المستعمرات تميل لوقف تزايد بعد 14 يوما ، وبعض المستعمرات تستمر في الزيادة في الحجم. قبل 21 يوما ، ويمكن أن تصنف مستعمرات في واحدة من الفئات الأربع : 1) أقل من 0.5 مم ، 2) 0،5-1 مم ، 3) 1-2 مم و 4) ≥ 2mm وفي القطر. عمليا ، ويشار إلى المستعمرات أصغر من قطر 2 مم إلى ما سلف مشتقة (الشكل 2) والمستعمرات ويشار في القطر ≥ 2mm وباسم مجلس الأمن القومي مشتقة (الشكل 3). عدد المستعمرات في القطر ≥ 2mm والخلايا في مجموع مطلي ، يمثل تواتر حسن النية الفعلية الخلايا الجذعية العصبية على المدى الطويل من تجديد الذات والقدرات المتعددة المحتملة. وقد قدرت مجموع neurosphere تشكيل التردد في خلية معينة من السكان بعد يوم 7-8 في تجربة وكالة الامن القومي موازية لتكون مشابهة لتشكيل مستعمرة مجموع السكان تردد نفس الخلية بعد 21 يوما في تجربة N - CFCA. وN - CFCA ومع ذلك ، يوفر شرطا أكثر تساهلا ، وذلك كل خلية يمكن أن تظهر إمكاناته الكاملة التكاثري.
| مكون | 2 يتطابق | 3 مكررات | 4 مكررات |
| NeuroCult NCFC المصل خالية متوسطة دون السيتوكينات | 1700 | 2550 | 3400 |
| NeuroCult NSC ملاحق الانتشار | 330 | 495 | 660 |
| EGF (10 ميكروغرام / مل) | 6.6 | 9.9 | 13.2 |
| bFGF (10 ميكروغرام / مل) ، فقط لخلايا البالغين | 3.3 | 4.95 | 6.6 |
| هيبارين محلول (0.2 ٪) ، فقط لخلايا البالغين | 3.3 | 4.95 | 6.6 |
| البنسلين / الستبرتوميسين (1:100) | 32 | 48 | 64 |
| الخلايا على العنوان التالي : 2.2 × 10 5 مثقف خلايا / مل أو 6.5 × 10 5 الخلايا الأولية / مل | 25 | 37.5 | 50 |
| الكولاجين الحل | 1300 | 1950 | 2600 |
الجدول 1. مكونات ثقافة كاملة مقايسة N - CFC.
الشكل 1. المستعمرات الممثل في N - CFCA ثقافة NSCs مرور الماوس one E14 بعد 7 أيام من الطلاء. قد المستعمرات عرض مختلفة مورفولوجيا والحجم. التكبير الأصلي ؛ 4X
الشكل 2. المستعمرات السلف الممثل المستمدة من مختلف الأحجام في N - CFCA ثقافة NSCs مرور الماوس one E14 21 يوما بعد الطلاء. كما هو مبين ، والمستعمرات مورفولوجية مختلفة ولكنها كلها أقل مم 2 في الحجم. التكبير الأصلي ؛ 4X
الشكل 3. الممثل الخلايا الجذعية النية الحسنة المستمدة مستعمرة في N - CFCA ثقافة مرور الماوس NSCs one E14 21 يوما بعد الطلاء. قد مستعمرات الخلايا الجذعية المستمدة عرض التشكل المختلفة (انظرشريط الفيديو) ، ولكن كلها 2mm و≥ في القطر. التكبير الأصلي ؛ 4X
Discussion
على الرغم من أن الفحص neurosphere 3،1،2 هو الأسلوب الأكثر شيوعا لعزل وتوسيع الخلايا الجذعية العصبية من مصادر متنوعة مثل الأنسجة الجنينية الكبار والجهاز العصبي المركزي ، فإنه لا يمكن قياس دقيق تردد مجلس الأمن القومي في مجتمع مختلط من الخلايا العصبية السلائف (الجذعية و الأسلاف) ، وليس هناك علاقة بين 1-1 عدد neurospheres وعدد الخلايا الجذعية النية الحسنة 4. لمعالجة هذا القيد ، وقد تم تكييفها وكالة الامن القومي الأصلي وذلك للسماح للالجذعية العصبية والأسلاف ليصل إلى قدرتها الانتشار الكامل لمدة ثلاثة أسابيع 5-7. على عكس وكالة الامن القومي السائل ، في N - CFCA هي في الواقع مستمدة clonally المستعمرات ، ومصفوفة الكولاجين شبه صلبة تمنع هجرة الخلايا واحد مطلي وتجميع المستعمرات. لنتائج متسقة مع هذا الاختبار فإننا نوصي بما يلي :
- ضمان وجود خلية واحدة في التعليق على التعليق الخلية الأصلية. تمر بك تعليق خلية واحدة من خلال شبكة تصفية 40 ميكرون الحجم وذلك لإزالة كتل غير فصلها.
- يبقي الحل الكولاجين على الجليد أو في البراد +4 درجات مئوية. الكولاجين هو العنصر الأخير لتضاف إلى خليط من التعليق الخلية كما congeals عن طريق زيادة درجة الحرارة.
- لا تنس أن تغذي ثقافة كل أسبوع. مضيفا أن التجديد المتوسطة تحتوي على عامل النمو (ق) مرة واحدة كل 7 أيام يسمح للخلايا أن يواصل الانتشار على مدى فترة ممتدة الثقافة.
- وقد تم تحسين الطلاء النهائية كثافة الخلايا لخلايا المستمدة من الخلايا العصبية سواء الأولية أو مثقف بحيث يكون العدد الكلي للمستعمرات اكتشفت بعد 21 يوما من تاريخ الثقافة في NCFC - A ضمن مجموعة لا تقل عن 5-20 المستعمرات. هذا النطاق يسمح الكشف عن المستعمرات NSC نادرة مشتقة> 2mm وقطرها في العينات مع توفير أعداد كافية من المستعمرات للتحليلات الإحصائية. اعتمادا على مصدر خلية البداية ، أقل بكثير (<50) وارتفاع أعداد المستعمرات يتم الحصول عليها في بعض الأحيان (> 250). ومستعمرات قليلة جدا نتيجة في 2mm و> المستعمرات في القطر يتم الكشف عن المستويات ، في حين أن العديد من المستعمرات أيضا سوف يؤدي إلى اكتظاظ anddepletion مكونات النمو المتوسطة مما أدى إلى فرز مستعمرة دقيقة. ولذلك سوف الخلية كثافة الطلاء يجب أن يتم تعديلها وفقا لذلك (أي زيادة أو تخفيض العدد الكلي للخلايا مطلي)
Disclosures
ينتمي واحد من المؤلفين ، لويس ألف شارون ، مع StemCell تكنولوجيز المحدودة ، الشركة المنتجة لبعض الكواشف المستخدمة في هذه الدراسة.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من خلال تمويل من مؤسسة Overstreet.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| NeuroCult NCFC medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05720 | |
| 0.05% trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Biosciences | 352340 | |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| Collagen | Reagent | Stem Cell Technologies | 04902 | |
| EGF | Growth factor | R&D Systems | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D Systems | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352070 | |
| 35 mm culture dishes | Culture ware | Stem Cell Technologies | 27100 | |
| Gridded scoring dishes | Culture ware | Stem Cell Technologies | 27500 |
References
- Azari, H., Rahaman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J Vis Exp. , (2010).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahaman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. J Vis Exp. , (2011).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Louis, S. A. Enumeration of Neural Stem and Progenitor Cells in the Neural Colony Forming Cell Assay. Stem Cells. , (2008).
- Golmohammadi, M. G. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26, 979-987 (2008).
- Louis, S. A., Reynolds, B. A. Neurosphere and Neural Colony-Forming Cell Assays. Protocols for Neural Cell Culture. 10, 1-28 (2010).
