1. Объекты, которые должны быть готовы Прежде чем приступить к сотовый Покрытие: Соответствующие объемы полной среде НСК получают путем смешивания NeuroCult НСК базальной среды и NeuroCult НСК распространения дополнений в 9:01 отношения, соответственно. Аликвоту NeuroCult NCFC бессывороточной среде без Цитокины не разморозится. Средний разогревается в 37 ° С водяной бане. Исходные растворы эпидермального фактора роста (ЭФР), основной фактор роста фибробластов (FGF-б) при концентрации 10 мкг / мл и гепарина на 0,2% готовы впереди. В зависимости от размера эксперимента, несколько 35-мм блюда культуры ткани необходимы для пластины клеток и один 150-200см пластиковые чашки Петри необходимо также провести дублировать 35 блюд и третий 35 мм блюдо для воды. 2. Сотовые приготовления: В зависимости от вашего эксперимента, клетки могут быть получены из взрослого или эмбриональных источников (первичные диссоциированных тканей или диссоциированных нейросферы). Рассеките тканей взрослого / эмбриональных мыши центральной нервной системы (ЦНС), либо диссоциируют взрослый / эмбрионального происхождения нейросферы, как описано выше 1,2, а затем: Суспензии отдельных клеток проходит через 40-мкм размер ячейки фильтра так, чтобы устранить не-диссоциированных сгустки. 10 мкл клеточной суспензии смешивается с 90μl из Трипановый синий выполнять клеток. Примечание: Другие соответствующие разведения клетка может также использоваться. При использовании первичных эмбриональных или взрослых производным нервных клеток, разбавленные суспензии клеток в концентрации 6,5 · 10 5 клеток / мл в полной среде НСК. Если с использованием клеток из диссоциированных нейросферы производным от взрослого или эмбриональные нервные клетки, разбавленные суспензии клеток в концентрации 2,2 · 10 5 клеток / мл в полной среде НСК. 3. Покрытие Ячейки в полу-твердый N-ЦАФД среда: Соответствующий объем следующие компоненты смешиваются в порядке, в зависимости от количества дубликатов. Здесь мы смешиваем сумму, необходимую для двух повторяет или дублировать блюд. Дополнительные номера дубликатов, пожалуйста, обратитесь к таблице 1. 1,7 мл NeuroCult NCFC бессывороточной среде без Цитокины 330 мкл NeuroCult НСК добавки распространения 6,6 мкл EGF (10μg/mL) 32 мкл Пенициллин / стрептомицин 3,3 мкл б-FGF (10μg/mL) необходимо использовать только при культивировании клеток, полученных от взрослых нервных клеток. 3,3 мкл гепарина (0,2%) необходимо использовать только при культивировании клеток, полученных от взрослых нервных клеток. 25 мкл суспензии клеток (в 2,2 х 10 5 клеток / мл клетки диссоциированных нейросферы или 6,5 х 10 5 клеток / мл первичных клеток из диссоциированных тканей ЦНС). Примечание: окончательный номера сотовых покрытие должно быть около 2500 клеток на 35 мм блюдо культуры для neurosphere клеток, полученных до 7500 клеток на 35 мм блюдо культуры для первичных клеток. В некоторых случаях конечная плотность покрытия клетка должна быть скорректирована путем проведения эксперимента ячейки титрования. Для статистического анализа, общее количество колоний обнаружены после 21 дней культуры должны быть в пределах не менее 50 – 150 колоний. Среде, содержащей клетки смешиваются мягко, а затем 1,3 мл холодного раствора коллагена передается клеточной суспензии и хорошо перемешивают, осторожно пипеткой, чтобы избежать введения каких-либо пузыри. Смешанный раствор разливают в центре каждого 35мм блюдо культуры (~ 1,5 мл / блюдо) и блюда наконечником мягко использованием круговых движений, чтобы смесь равномерно распределить по поверхности тарелки. . Дублировать 35 блюд мм культуры помещают в 100 мм пластины Петри. Крышка новых 35 мм блюдо снимается и открытых блюдо будет также размещена в те же 100 мм блюдо Петри. Стерильная вода добавляется к этой открытой 35 мм блюдо для поддержания оптимальной влажности в течение инкубационного периода. Площадь пластин биопроб (245 мм) используются, когда более 35 мм повторить блюда были созданы. Опять же, включают в себя 2 или 3 открытых 35 мм блюд, содержащих стерильной водой. Пластины передается термостат при температуре 37 ° C, 5% СО2 и 95% влажности. Коллагена застывает за счет повышения температуры и образование геля происходит в течение примерно одного часа. Культур не должна быть нарушена в это время. Культивируемые клетки инкубируют в течение 21 дней (различия в колонии размер может быть четко отделены после 21 дней). 4. Подготовка Пополнение среднего и кормление Культура: При N-ЦАФД культуры инкубируют в течение длительного периода времени (21 дней), культуры должны быть поданы с соответствующим полным NeuroCult Пополнение среду приготовить свежую следующим образом: 4,5 мл NeuroCult НСК базальной среды, смешивают с 0,5 мЛ NeuroCult НСК добавки распространения и факторов роста, добавляется: 250 мкл 10μg/mL EGF (для придания конечной концентрации 0,5 мкг / мл EGF) 125 мкл 10μg/mL б-FGF (для придания окончательной концентрации 0.25μg/mL б-FGF) необходимо использовать только при культивировании клеток, полученных от взрослых нервных клеток. 125 мкл 0,2% гепарин, необходимо использовать только при культивировании клеток, полученных от взрослых нервных клеток. 60 мкл соответствующего полного среднего Пополнение NeuroCult (для эмбриона или взрослой клетки) добавляется в центре каждого NCFC блюдо Пробирной раз в 7 дней, в течение всей NCFC инкубации культуры Пробирной (21 дней). 5. Подсчет очков N-CFC Пробирной Производные колоний и Вычисление частоты добросовестных NSCs и нейронные клетки-предшественники: Каждый 35 мм культуры блюдо делается на сетке блюдо забил с сеткой размером 2,0 мм х 2,0 мм, и тогда оба блюда помещаются на столик микроскопа. Использование малой мощности (2.5X – 5X) объектива, каждое блюдо отсканированы и колонии забили в зависимости от их размеров. Колонии разделить на две основные категории: Менее 2 мм в диаметре ≥ 2 мм в диаметре 6. Представитель Результаты: Как и в neurosphere анализа, посеянных клеток в N-CFC анализа начинают размножаться и делать небольшие колонии клеток в течение 3 – 7 дней после покрытия (рис. 1). Через две недели, колонии разных размеров могут быть выделены. Хотя большинство колоний, как правило, перестают расти после 14 дней, некоторые колонии продолжают увеличиваться в размерах. Днем 21, колонии могут быть отнесены к одной из четырех категорий: 1) менее 0,5 мм, 2) 0,5 – 1 мм в диаметре, 3) 1 – 2 мм и 4) ≥ 2 мм в диаметре. Практически, колонии меньше 2 мм в диаметре, называются предшественников производные (рис. 2) и колоний ≥ 2 мм в диаметре, называются НСК производные (рис. 3). Число колоний ≥ 2 мм в диаметре в общем посеянных клеток, представляет собой частоту фактического добросовестных нервные стволовые клетки с долгосрочными самообновлению и несколькими потенциальными возможностями. Общая neurosphere формирования частоты в частности популяции клеток через 7-8 дня в параллельном эксперименте NSA, по оценкам, быть похожими на общую колониеобразующих частота же популяции клеток после 21 дней в N-ЦАФД эксперимента. N-ЦАФД однако, обеспечивает более либеральные состоянии, так как каждая ячейка может показать весь свой пролиферативный потенциал. Компонент 2 воспроизводит 3 воспроизводит 4 воспроизводит NeuroCult NCFC бессывороточной среде без Цитокины 1700 2550 3400 NeuroCult НСК распространения добавки 330 495 660 EGF (10 мкг / мл) 6,6 9,9 13,2 bFGF (10 мкг / мл), только для взрослых клеток 3,3 4,95 6,6 Раствор гепарина (0,2%), только для взрослых клеток 3,3 4,95 6,6 Пенициллин / стрептомицин (1:100) 32 48 64 Клетки по адресу: 2,2 х 10 5 культуре клеток / мл или 6,5 х 10 5 первичных клеток / мл 25 37,5 50 Коллаген решения 1300 1950 2600 Таблица 1. Компоненты полного N-CFC анализа культуры. Рисунок 1. Представителем колоний в N-ЦАФД культуры прохождения одна E14 NSCs мыши 7 дней после покрытия. Колонии могут отображаться различные морфологии и размера. Оригинальные увеличении; 4x Рисунок 2. Представителю предшественников производные колоний разного размера в N-ЦАФД культуры прохождения одна E14 мыши NSCs 21 дней после покрытия. Как показала практика, колонии различной морфологией, но и все менее 2 мм. Оригинальные увеличении; 4x Рисунок 3. Представителю добросовестных стволовых клеток производных колонии в N-ЦАФД культуры прохождения одна E14 NSCs мыши через 21 день после покрытия. Стволовые клетки производные колонии могут отображаться различные морфологии (см.видео), но все они ≥ 2 мм в диаметре. Оригинальные увеличении; 4x