Summary
이 기술 문서는 Invitrogen에서 상용 NuPAGE 전기 영동 미니 젤 시스템을 사용하여 표준 서양 모래 바닥 절차를 설명합니다.
Abstract
서양은 모래 바닥 (또는 immunoblotting하는) 조사관은 단백질의 표현을 확인할 수 있도록 표준 실험실 절차, 다른 샘플에서 단백질 현재의 상대적 양을 결정하고, 공동 immunoprecipitation 실험의 결과를 분석할 수 있습니다. 이 방법에서는 대상 단백질은 조직 homogenate 또는 추출물의 주어진 샘플의 특정 기본 항체와 함께 발견됩니다. 분자량에 따른 단백질 분리는 SDS - PAGE를 denaturing 사용하여 이루어진다. 멤브레인로 전송 후, 대상 단백질은 특정 기본 항체와 탐지하고 chemiluminescence에 의해 감지.
최초의 설명 이후 서양 모래 바닥 기법 사전 주조 젤류 및 사용자 친화적인 장비를 포함한 여러 개선을 거쳐있다. 저희 연구실에서는, 우리는 Invitrogen에서 상용 NuPAGE 전기 영동 시스템을 사용하도록 선택했습니다. 그것은 혁신적인 중립 산도, 불연속 SDS - PAGE, 사전 캐스트 미니 젤 시스템입니다. 8개월에서 일년에 이르기까지 사전 주조 젤의 긴 선반 인생); II) 1에서 400 KDA하는 분자 무게의 광범위한 분리 범위는 유형에 따라이 시스템을 포함한 전통적인 Laemmli 기술을 통해 몇 가지 장점을 소개 의 겔 사용되는;) 및 III보다 다재 다능한 (아크릴 아미드 비율, 젤의 종류 및 실행 버퍼의 이온 조성의 범위).
이 비디오 문서에서 설명하는 절차는 4-12% 비스 - 트리스 기울기 젤류 및 MES는 Invitrogen의 NuPAGE 전기 영동 시스템을 사용하여 서양 얼룩을 수행하는 방법에 대한 그림으로, 버퍼를 실행하는 BIS - 트리스 불연속 버퍼 시스템을 사용합니다. 저희 연구실에서는, 우리는이 서양 모래 바닥 방법을 사용하여 다양한 생화 학적 응용 프로그램을위한 좋은 재현성 결과를 획득했습니다.
Protocol
겔 전기 영동
기술 참고 : 절차를 시작하기 전에 단백질 샘플을 준비했습니다.
이 첫 번째 단계 동안 샘플에서 단백질은 denaturing polyacrylamide 젤 전기 영동 (PAGE)를 사용하여 분자량에 따라 구분됩니다. 단백질 샘플이 10 분 동안 70 ° C에서 가열되고 나면 리튬 Dodecyl의 황산 (LDS)를 읽어 NuPAGE ® LDS 샘플 버퍼 변성 상태 polypeptides을 유지합니다. 강한 감소 에이전트는 두 번째와 세 번째 차 구조 (DTT, 이황화 채권을 망가뜨릴 수있는)를 제거하기 위해 함께 사용됩니다. 또한, 샘플 단백질은 부정 청구 LDS에서 설명되고 따라서 긍정적인 충전 전극쪽으로 젤의 아크릴 아미드 메쉬를 통해 이동합니다. 이것은 분자량 (킬로 달톤스, KDA로 측정)에 따라 분리 수 있습니다.
샘플 준비 및 PAGE 절차에 대한 자세한 단계별 절차는 Invitrogen 웹사이트 2 발견하거나 NuPAGE 기술 가이드 3인치 수 있습니다
기술 팁
- I) 젤의 acrylamid 농도 (하단의 더 나은 해상도로 인해 큰 아크릴 아미드 농도와 함께 : Invitrogen NuPAGE 비스 - 트리스 discontinous 버퍼 시스템에서 단백질과 젤의 후속 분리 범위의 전기 영 동적 이동성은 두 가지 요인에 따라 달라집니다 분자량 단백질)과 II) 실행 버퍼, 걸레 또는 MES의 후행 이온. 당신이 달성하고자하는 분리 범위에 해당하는 조합을 선택하려면, 젤 마이 그 레이션 차트 1 참조하십시오. 웰스의 젤과 전화 번호의 두께는 볼륨 및 각각 부하 계획 샘플의 수량에 따라 달라집니다.
- 당신이 젤의 우물에 샘플을 로드할 때, 적어도 하나의 차선은 분자량 마커 (또는 사다리)에 사용됩니다. 이러한 단백질 표준은 여러 회사에서 상업적으로 사용할 수 있으며, 일반적으로 사용자가 마이 그 레이션 진행에 따라 허용 보이는 밴드를 형성하는만큼, 정의 분자 무게를 가지고 스테인드 단백질의 혼합물로 이루어져 있습니다. 귀하의 겔 해상도와 호환되는 분자 중량의 범위를 선택하십시오.
- 좋은 심지어 마이 그 레이션 패턴을 달성하기 위해 우리는 샘플이나 1X LDS 샘플 버퍼의 비슷한 볼륨으로 젤의 모든 우물을 로딩하는 것이 좋습니다.
이전
기술 참고 : 이전 단계를 시작하기 전에 전송 버퍼 (10 % 메탄올로 1X)과 ° C 추운 방에 4 미리 냉정을 준비합니다.
항체 검출에 액세스할 단백질을하기 위해, 그들은 nitrocellulose 막에 겔에서 electroblotting로 전송됩니다. 단백질 바인딩은 막과 단백질 사이의 소수성 상호 작용뿐만 아니라 요금 상호 작용을 기반으로합니다.
(Polyvinylidene 불소 (PVDF) 멤브레인도 대안으로 사용할 수 있습니다.이 경우, PVDF 막는 메탄올 최소한 30초 사용하기 전에 미리 젖다 필요합니다.)
귀하의 연구실이 Invitrogen의 XCell II를 갖춘 경우에는 바이오 래드 미니 트랜스 - 블롯 전기 전송 셀 또는 참조 2-3을 사용하는 경우 송금 절차에 대한 자세한 단계별 프로토콜 참조 4 찾을 수 있습니다 ™ 모듈을 얼룩.
이 과정의 결과로, 단백질은 얇은 표면 레이어에 노출되어 있으며, 검색을위한 준비. 겔에서 막에 단백질의 양도의 균일 성과 전반적인 효과는 가역 개양귀비빛의 S 염료 막 얼룩에서 확인하실 수 있습니다.
개양귀비빛의 S 얼룩 절차 (선택 사항) :
- 단백질 전송 후 (단백질가 직면하고) 배양 트레이에 멤브레인를 놓습니다.
- 멤브레인을 커버하고 부드러운 교반과 함께 최소한 30 초 정도 부화 개양귀비빛의 S 스테 이닝을 추가합니다.
- 배경 분명히 때까지 증류수로 막을 린스.
- 2-3분 위해 증류수를 실행과 함께 막을 Destain.
- 차단 솔루션의 멤브레인 (아래 참조) 놓습니다.
기술 도움말 :
- 우리는 단백질이 노출된하는 측면과 샘플의 방향을 나타내기 위해 단백질 전송하기 전에 연필로하여 막을 라벨 부착하는 것이 좋습니다.
- 개양귀비빛의 S 얼룩 및 분자량 마커 모두 다른 항체로 인한 부품을 프로빙에 대한 전송 후 멤브레인를 잘라 사용할 수 있습니다
면역 :
기술 참고 :이 면역 절차는 단지 지침으로 제공됩니다. 최적화는 각 개미에 대해 필요할 수 있습니다ibody, 구체적인 정보는 상용 항체 대부분의 데이터 시트 (예 : 희석, 부화 시간 등 작업)에서 찾을 수 있습니다.
이 마지막 과정에서 대상 단백질은 특정 항체를 사용하여 감지하고 영화에 밴드로 표시됩니다. 밴드 강도는 대상 단백질 존재의 양에 따라 달라집니다 반면 밴드의 위치는 대상 단백질의 분자량의 따라 달라집니다.
일반적으로이 세 substeps 후에 이루어집니다 :
- 차단 : 멤브레인 (막의 초과 공간이 일반적인 단백질의 희석 용액으로 뒤덮혀있다)와 항체가 아닌 구체적인 상호 작용을 방지하려면.
- 프로빙 : 관심의 단백질은 특정 의해 감지 기본 항체 . 언바운드 기본 항체가 씻겨되면 멤브레인이 기자에 링크된 다른 항체에 노출 효소 , 양고추냉이 퍼옥시데이즈 (HRP). 이 이차 항체는 일차 항체의 종류 특정 부분 (예 : 안티 - 토끼 이차 항체 어떤 토끼 공급 차 항체에 바인딩합니다)에 대한 감독입니다.
- 검색 : chemiluminescent 에이전트가 보조 항체에 HRP에 노출되면 형광을 발하게 되죠 기판으로 사용됩니다. 이 반응은 장소와 탐지 단백질의 금액에 비례하여 발광을 생산하고 있습니다. 빛이 그런 다음 사진 필름에 의해 감지됩니다.
일반 단계별 절차는 아래 제공됩니다. 기타 자세한 절차는 ECL 플러스 서양 모래 바닥 감지 시약의 사용 설명서 5 또는 데이터 시트 대부분의 상용 항체를 동반에서 찾을 수 있습니다. 부화 시간, 항체 희석하고, 차단 및 세척 솔루션은 경험적으로 각 항체에 대한 최적화해야합니다.
면역 절차 :
- 전체 멤브레인을 충당하기 위해 PBS 1 % 카제인 차단 솔루션의 충분한 볼륨 잠복기하여 불특정 바인딩을 차단합니다. 상온에서 최소 30 분 락커에 장소 또는 4 박 ° C.
- 기본 항체 (관심의 단백질에 대한 구체적인)와 세포막을 품어. 기본 항체는 솔루션을 차단에 희석한다. 대부분의 항체에 대한 완전한 구속력은 부드러운 선동에 따라 상온에서 1~2시간 보육 후에 이루어진다. 또는, 인큐베이션 단계는 잡음 비율로 신호를 증가 ° C ~ 4에서 하룻밤을 수행할 수 있습니다.
- 솔루션을 (폐기 또는 ° C -20 ° C 반복적으로 사용하기 위해 4 유지) 제거하고 신속 한 번 멤브레인 씻으십시오. 다음 PBS로 3X10 분, 활발한 잡고 상온에서 0.05 % 트윈 20 (PBST).
- 솔루션을 차단에 희석 HRP - 결합 차 항체로 막을 품어. 기본 항체가 자랐어요 종족의 IgG 부분을 인식 항체를 선택합니다. 부화는 부드러운 선동에 따라 상온에서 1 시간 동안 수행됩니다.
- 솔루션을 삭제하고 신속 한 번 멤브레인 씻으십시오. 활발한 잡고 실온에서 PBST로 다음 3X10 분.
- 제조 업체 지침에 따라 chemiluminescent 탐지로 진행합니다. 우리는 GE 헬스케어 (특정 지침에 대한 참조 5 참조)에서 ECL 플러스 서양 모래 바닥 감지 시약을 사용합니다.
- 귀하의 사란 랩에서 막 또는 autoradiography 카세트 내부 주머니와 장소를 놓습니다. 초과 액체 드레인 모든 기포를 제거했는지 확인하십시오.
- 어두운 방에 막 수있는 사진 필름을 쉽게받을 수 있습니다. 1 분 노출 시간 시작하고 원하는 신호 강도에 따라 조정합니다.
기술 도움말 :
- 비 특정 바인딩의 차단은 단백질의 희석 용액에 멤브레인를 삽입하여 이루어진다. 우리는 일반적으로 1 %의 카제인하지만, 사용 소 혈청 알부민 의 대안으로 사용할 수 있습니다 (~ 2퍼센트 BSA) 또는 비 뚱뚱한 건조 우유 (~ 5 %).
- 트리스 버퍼 살린 (TBS)이 절차를 통해 대신 PBS에 사용할 수 있습니다. 당신이 phosphospecific 항체와 멤브레인을 탐사하려는 경우 우리는 TBS를 사용하는 것이 좋습니다.
- 의 사용은 빛이 어둠 속에서 autoradiography 카세트의 하단에 도청 스티커 (예, Stratagene의 Glogos ® II 방사능의 마커)는 분석 단계 동안 영화와 멤브레인 정렬하는 데 도움이 될 것입니다.
분석
당신이 필름을 노출 했으므로, 당신은 실용적인 측면에서, 모든 서부 하나의 좋은 단일 밴드로 단백질을 보여줄 것을 깨닫게됩니다. Additiona내 밴드는 기본 및 보조 두 항체의 비 특정 바인딩으로 인해 나타날 수 있습니다. 이 배경 신호가 면역 절차를 최적화하여 줄일 수있다. 또한, 적절한 제어 (예 : untransfected 세포, siRNA - 처리 세포 등)이 항체의 특이성과 멤브레인의 대상 단백질의 정확한 위치를 결정하기 위해 도움이 될 것입니다.
필름에있는 멤브레인에서 스테인드 단백질 표준 밴드의 위치를 표시한 다음, 각 분자량의 로그를 플롯 해당 상대 유동성 (X 축)에 대한 단백질 기준 (Y 축)의. 상대 유동성 (RF)는 (겔 앞)로 이동했습니다 단백질 거리 추적 염료 또는 낮은 분자량 마커에 상대적으로 원산지는 점 (젤 상단)에서 이동되었습니다 거리의 비율에 사용되는 용어입니다 . 기울기와 y - 절편의 값을 얻기 위해 표준 곡선의 회귀 라인을 확인합니다. 타겟 단백질의 알려지지 않은 분자 중량 (크기)는 RF 다음과 같은 수정된 방정식을 사용하여 추정됩니다 :
분자량 로그 = (경사) (대상 단백질의 이동성 또는 RF) + Y - 절편
(자세한 지침에 대한 참조 6 참조).
표현 수준 approximations은 구조 단백질 (예 : tubulin 또는 굴지)이나 GAPDH 같은 가사 유전자 제품의 위해 대상 단백질의 밴드 강도를 비교하여 촬영하고 있습니다. 이것은 소위 "로딩 제어"는 샘플 사이의 변경해서는 안되며, 특정 주 항체를 사용하여 드러났습니다. 이미지가 더욱 단백질 얼룩의 금액을 비교하여 평가하고 광학 밀도의 측면에서 결과를 수치 densitometry로 분석됩니다.
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Discussion
여기에 제시 절차는 MES는 Invitrogen NuPAGE Novex 전기 영동 시스템을 사용하여 페이지를 denaturing의 예로 버퍼를 실행하는 비스 - 트리스 젤을 사용합니다. 또한이 사전 캐스트 겔 시스템은 denaturing 또는 비 - denaturing 조건뿐만 아니라 아래의 단백질 분리 수 있습니다 분자 무게의 광범위한 (위한 36-400 KDA에 BIS - 트리스 젤에 대한 1-200 KDA에서 트리스 - 숙박 아세테이트 젤). 실험에 따라, 당신은 여기에서 설명한 서양 모래 바닥 기법의 일부를 수행하고 직접 겔 얼룩 절차 (예 : 은색 또는 쿠매시의 얼룩) 또는 다른 면역 방법 (예 : colorimetric 또는 형광등)를 사용하도록 선택할 수 있습니다.
우리는 일상적으로 다양한 어플 리케이션을위한 우리 연구실에 Invitrogen NuPAGE Novex 전기 영동 시스템을 사용의 몇 가지 예제는 참고 문헌 7-9에서 찾을 수 있습니다.
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Acknowledgments
이 작품은 건강과 조지 E. 휴이트 재단 교제 (AP)의 국립 연구소에서 보조금에 의해 지원되었다.References
- Complete western-blot protocol from the Invitrogen website. , https://commerce.invitrogen.com/index.cfm?fuseaction=iProtocol.unitSectionTree&treeNodeId=A2C5758BC7C3438B01378A0940376C8E Forthcoming.
- Instruction Manual, Mini Trans-Blot Cell. , http://www.bio-rad.com/cmc_upload/0/000/013/280/M1703930E.pdf Forthcoming.
- ECL Plus Western blotting detection reagents instruction. , http://www5.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/139B41E53EDC6210C1256EB40044ACE3/$file/RPN2132PL_Rev_D_2006_web.pdf Forthcoming.
- Estimation of protein molecular weights by SDS gel electrophoresis, GE Healthcare Website. , http://www1.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/elpho_applications~elpho_applications_1d_protein_analysis~elpho_sds_page~Elpho_1D_SDS+PAGE+2+Estimation+of+protein+molecular+weights+by+SDS+gel+electrophoresis+~3.+Procedure Forthcoming.
- Yeromin, A. V., et al. Molecular identification of the CRAC channel by altered ion selectivity in a mutant of Orai. Nature. 443, 226-229 (2006).
- Zhang, S. L., et al. Store-dependent and -independent modes regulating CRAC channel activity of human Orai1 and Orai3. J. Biol. Chem. 283, 17662-17671 (2008).
- Penna,, et al. The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers. Nature. , Forthcoming.
