Summary
我们描述了一个协议，来观察和分析细胞不对称受体图案基板的滚动轨迹。由此产生的数据是有用的无标记细胞分离和分析受体图案基板工程。
Abstract
细胞正交一个流的不对称受体模式滚动的横向位移提出了新设备的开发，无标记的分离和分析细胞1的机会。这种设备可用于连续流的分离，或受体模式调节，区分不同的细胞表型或受体表达水平的附着力侧向位移。了解细胞受体图案的基板上滚动的轨迹的性质为底物和这类设备的设计工程是必要的。
在这里，我们展示了一个协议，为研究细胞滚动轨迹上的不对称受体模式，支持滚动细胞粘附2。采用微接触印刷镀金的幻灯片，在流室中定义良好，微米尺度模式的P -选择素受体。 HL60细胞表达PSGL - 1配体3流向整个领域的图案线条和一个倒置的明视野显微镜观察。推出的细胞和跟踪的模式，沿倾斜的边缘，造成横向偏转 1 。每个细胞通常推出一个沿图案边缘一定距离（定义为边缘跟踪长度），从边缘分离，并重新连接到下游的模式。虽然这支队，使其难以跟踪从入口到出口的流室的一个单元格的整个轨迹，粒子跟踪软件用于分析和收益率在时间的细胞滚动的轨迹，当他们在一个单一的受体纹线。的轨迹，然后检查，以获取细胞的滚动速度和不同图案的每个单元格的边缘跟踪长度的分布。
此协议是有用的量化细胞上的受体模式滚动轨迹，以及与这些工程模式的角度和剪应力等参数。这些数据将被用于无标记细胞分离和分析的微流体装置的设计。
Protocol
1。 HL60细胞滚动
1.1。制作图案的衬底。
- 利用微接触印刷（μCP）4-7交替聚乙二醇分子自组装膜（SAMs）的镀金玻片：编造微接触印刷聚二甲基硅氧烷（PDMS）邮票的定义与倾斜角α= 10的受体模式°由SU - 8的成型工艺。清洁使用Piranha溶液（3:1硫酸的混合物，30％双氧水）20分钟的金表面，然后用丰富的DI水，在24.5 ° C，使用前的表面。油墨5mm的聚乙二醇溶液在乙醇的PDMS邮票。干燥空气中20分钟的邮票。轻轻地在金表面上的邮票40秒，并确保有一个良好的接触之间的金表面和邮票。没有多余的压力是必需的。用乙醇冲洗表面，干下的N 2流。
- 孵育的基板，在P -选择素（15微克/毫升在DPBS）的解决方案，使用灌注室（电子显微镜科学版），3小时24.5 ° C至模式与P -选择其余地区。丰富DPBS冲洗表面。
- 回填表面与BSA（1毫克/毫升在DPBS）1小时，以阻断非特异性相互作用。丰富DPBS冲洗表面。
1.2。细胞在流室的滚动实验。
- 流HL60细胞在一个长方形的流室图案的表面（〜10 5细胞/ mL）（Glycotech，公司; = 1.0厘米，长度宽度 w = 6厘米， 高度为h = 0.0127厘米）悬挂在24.5 ° C 。使用注射泵（世界精密仪器，SP230IW）生成75μL/ min的流率，约0.5达因/厘米2（〜0.05 PA）与相应的剪应力。计算剪应力τ通过平面Poiseuille流方程τ= 26μQ/wh，其中μ是运动粘度（0.001002霸），Q为体积流量，W流室的宽度，h是高度流室。
- 使用一个安装摄像头（安道尔IXON 885）记录，HL60细胞P -选择使用4基板用粘合剂滚动相互作用×目标倒置显微镜（尼康TE2000 - U），通常在每秒1帧的速度，持续时间为300第执行三个独立的实验中，每个剪应力和模式倾角。从每个实验中获得的平均值，平均值和标准偏差的现状数据。
- 数据分析。
分析一个定制的MATLAB（MathWorks公司）计划，利用粒子跟踪免费8生成沿着图案线条边缘的轨道图像序列。延长，直至一个P -选择波段结束的曲目选择和安装两个直线段 - 流对齐，其他与图案边缘对齐。这两个部分，然后用于计算边缘跟踪长度，轧制速度上的优势，和轧制速度上的平原地区。
2。代表性的成果：
图（a）对HL60滚动相互作用的P -选择使用4 ×目标基板用粘合剂的视频转换的显微镜图像显示。光明和黑暗的地区对应的P -选择素受体 和PEG地区，分别为图（b）显示了使用一个定制的Matlab程序取得的轨道。边缘的倾斜角度为10 °和剪应力0.5达因/厘米2。边缘跟踪的长度，L E，D，位移，并滚动速度上的优势，里面的乐队，V E和V P，分别描述图（C - 1）图（C - 2）显示边缘跟踪长度分布（记录的细胞数量）。插图显示了L E的平均价值和轧制速度上的优势（V E）和内带（V P）在倾角α= 10 °，约0.5 DYN / 厘米 2流体剪应力。误差棒代表一个标准差，其中n = 3的每个条件重复实验（3复制表面）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
我们已经描述了一个协议，以研究细胞滚动的轨迹上的不对称受体图案表面采用微接触印刷2。可用于光学显微镜图像显示PEG和P -选择地区之间的鲜明对比的图案表面，以确认是否是成功的冲压。可以观察锐利，直边，冲压时表现良好。硬邮票的紧迫，可能会导致邮票变形模式的精度限制。当油墨浓度过高或冲压时间过长，可能会获得波浪边。邮票和表面之间的接触不好导致非均匀PEG模式时，邮票的大小太小（<0.5厘米2 ）。不新鲜的油墨解决方案可能会导致细胞因为钝化能力下降，P -选择，PEG图案地区滚动。实际的倾斜角度可以计算出从自由流动的细胞，不与表面相互作用的模式和轨迹的图像。这里描述的实验产量约单个细胞滚动沿图案边缘的事件的信息，但是，它是很难自动跟踪细胞分离一个模式，重新装上另一种模式。变着花样的间距，例如，可能使一个单一的细胞遇到多个边缘跟踪。这种能力可以使更高的分辨率，区分不同轧制的特点，在单细胞水平的细胞。由于细胞滚动行为取决于对细胞的配体，我们推测，这样的实验可能使设计适当的模式，分开不同的细胞表型， 根据其滚动的行为3，9-12差异。细胞分离和细胞配体和图案不对称受体之间的相互作用为基础的分析设备的设计，因此，这项工作可以是有用的。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这个项目是由德什潘德在麻省理工学院技术创新中心（RK和JMK）和美国国家科学基金会职业奖0952493 RK通过化学和生物分离方案支持。我们感谢为士兵纳米技术（ISN）和麻省理工学院微系统技术实验室（MTL），利用其设施研究所。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human promyelocytic leukemia cells | ATCC | CCL-240 | HL60 cells |
| Gold-coated glass slides | EMF | TA134 | Gold slides |
| (1-Mercaptoundec-11-yl)tetra(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | 674508 | PEG |
| Recombinant human P-selectin | R&D Systems | ADP3-050 | P-selectin |
| Bovine serum albumin | Rockland Immunochemicals | BSA-50 | BSA |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Mediatech, Inc. | 21-030 | DPBS |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | 316989 |
References
- Karnik, R., Hong, S., Zhang, H., Mei, Y., Anderson, D. G., Karp, J. M., Langer, R. Nanomechanical control of cell rolling in two dimensions through surface Patterning of receptors. Nano Lett. 8 (4), 1153-1158 (2008).
- Lee, C. H., Bose, S., Van Vliet, K. J., Karp, J. M., Karnik, R. Examining Lateral Displacement of HL60 Cells Rolling on Asymmetric P-selectin Patterns. Langmuir. 27 (1), 240-249 (2011).
- Norman, K. E., Moore, K. L., McEver, R. P., Ley, K. Leukocyte rolling in-vivo is mediated by p-selectin glycoprotein ligand-1. Blood. 86 (12), 4417-4421 (1995).
- Bernard, A., Delamarche, E., Schmid, H., Michel, B., Bosshard, H. R., Biebuyck, H. Printing patterns of proteins. Langmuir. 14 (9), 2225-2229 (1998).
- James, C. D., Davis, R. C., Kam, L., Craighead, H. G., Isaacson, M., Turner, J. N., Shain, W. Patterned protein layers on solid substrates by thin stamp microcontact printing. Langmuir. 14 (4), 741-744 (1998).
- Mrksich, M., Whitesides, G. M. Using self-assembled monolayers to understand the interactions of man-made surfaces with proteins and cells. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 25, 55-78 (1996).
- Tan, J. L., Tien, J., Chen, C. S. Microcontact printing of proteins on mixed self-assembled monolayers. Langmuir. 18 (2), 519-523 (2002).
- Matlab Particle Tracking. , Avaliable from: http://physics.georgetown.edu/matlab/ Forthcoming.
- Lee, D., King, M. R. Microcontact Printing of P-Selectin Increases the Rate of Neutrophil Recruitment Under Shear Flow. Biotechnology Progress. 24 (5), 1052-1059 Forthcoming.
- Greenberg, A. W., Hammer, D. A. Cell separation mediated by differential rolling adhesion. Biotechnol. Bioeng. 73 (2), 111-124 (2001).
- Higuchi, A., Tsukamoto, Y. Cell separation of hepatocytes and fibroblasts through surface-modified polyurethane membranes. J. Biomed. Mater. Res. Part A. 71A (3), 470-479 (2004).
- Alexeev, A., Verberg, R., Balazs, A. C. Patterned surfaces segregate compliant microcapsules. Langmuir. 23 (3), 983-987 (2007).
