Summary
תסיסנית האשכים melanogaster ניתן במהירות וביעילות מבודדים מן הזכרים הבוגרים באמצעות מחטים לנתח. בעזרת תרגול, ניתן לבודד בקלות בתוך יום או יומיים סכום של האשכים מספיק לניתוח DNA או RNA על ידי רצף תפוקה גבוהה יותר או מסורתי או בשיטות הביולוגיה המולקולרית של חלבון עבור מבחני נוגדנים או אנזים מבוססות.
Abstract
האשכים של תסיסנית melanogaster לספק מודל חשוב ללימוד תחזוקה בתאי גזע והתמיינות, המיוזה, וכן סומה-germline אינטראקציות. האשכים הם מבודדים בדרך כלל 0-3 ימים לאחר eclosion ממקרה גלמי מן הזכרים הבוגרים. האשכים של wild-type זבובים נבדלים בקלות ברקמות אחרות, כי הם צהובים, אבל האשכים של זבובים מוטנטים לבן, רקע גנטי משותף ניסויי מעבדה דומים בצורת וגם צבע במעיים לעוף. ביצוע לנתיחה בשקופית מיקרוסקופ זכוכית עם רקע שחור עושה זיהוי האשכים הרבה יותר קל. האשכים יוסרו מן הזבובים באמצעות מחטים לנתח. לעומת פרוטוקולים להשתמש במלקחיים לנתיחה האשכים, השיטה שלנו היא הרבה יותר מהר, מה שמאפשר לאדם מיומן לנתח האשכים 200-300 wild-type זבובים לשעה, מניב 400-600 האשכים. האשכים של זבובים לבן או מוטציות כי להקטין את גודל האשכים קשה יותר לנתח ובדרך כלל תשואה 200-400 האשכים לשעה.
Protocol
- הפוך מיקרוסקופ זכוכית שקופית עם רקע שחור: חותכים נייר לבן 20 # לגודל זהה שקופיות מיקרוסקופ. צבע אחד בצד של שחור שקופיות בגודל הנייר באמצעות סמן קבע (למשל, לנוכל). החל דבק לבן (של אלמר) לצד שחור לדבוק הנייר לשקופית. השקופית ניתן לעשות שימוש חוזר. שימוש ¾ "הקלטת תווית (Fisherbrand), לאבטח את השקופית מיקרוסקופ, זכוכית בצד למעלה, אל משטח CO 2 לטוס כדי לתקן את זה במקום.
- איסוף 0-3 הישן יום זבובים זכרים.
- הכן דלי קרח, פוספט שנאגרו מלוחים (PBS), מחטים לנתח.
- לטשטש 50-100 זבובים באמצעות זרם של CO 2 ולהעביר אותם מבקבוק או בקבוקון לרפד את לטוס ליד המגלשה מיקרוסקופ.
- פיפטה ~ 50 μl קר כקרח PBS לירידה באמצע שקופיות מיקרוסקופ.
- בעדינות להרים זבוב זכר עם הניתוחים מחט לטבול את איזמל המנתחים לתוך PBS, מגע עדין הצד הגחוני (כלומר, ליד הכנפיים) של הזבוב עם מחט ולמקם אותו לתוך ירידה של PBS.
- מקום אחד המחט על לטוס באמצע, בין החזה ועל הבטן, דוחף בחוזקה כלפי מטה. מניחים את המחט אחרים בין השישית (A6) והשביעית (A7) קטעים בטן (הפסים השני והשלישי מלמטה); למשוך את הבטן מן החזה.
- להקניט את האשכים מלבד איברים אחרים, במיוחד במעיים. במיוחד מוטנטים לבן, האשכים והבטן נראים דומים. ההבדלים העיקריים הם כי האשכים תמיד באים בזוגות; אשך אחד יש דפוס ספירלה והוא לבן בצבעו יותר במעיים.
- אחסן את האשכים ב קר כקרח PBS בצינור microcentrifuge פוליפרופילן.
נציג תוצאות:
באיור 1. להציג הגבי של מערכת הרבייה של הגבר, החל flybase.org/reports/FBim0000074.html. Flybase ייחוס:... "אחרי 38 איור בעמוד 508 של מילר (1950) ע 'מילר אנטומיה היסטולוגיה פנימיים של Imago של תסיסנית melanogaster ב מ Demerec, עורך, ביולוגיה של תסיסנית, פרק 6, עמודים 420 - 534. Cold Spring Harbor Laboratory לחץ, מהדורת פקסימיליה, 1994. זכויות יוצרים 1994 על ידי Cold Spring Harbor Laboratory לחץ. השימוש נעשה ברשות סוג של Cold Spring Harbor Laboratory (CSHL) לעיתונות. ראה http://www.cshlpress.com ".
Discussion
אנו מספקים פרוטוקול לבודד את האשכים של הזכר הבוגר תסיסנית melanogaster. בגלל הטכניקה דורשת תיאום two אחד ידיים, מיומנות באה רק עם תרגול.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
המחברים מודים ואסיה Vagin מציגה את הטכניקה הזו למעבדה שלנו.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting needle | Tool | Fisher Scientific | S17346 | |
| Micro Slides, Plain | Tool | Fisher Scientific | 12-553 | |
| Microscope Light | Tool | Schott AG | KO-1500 | |
| CO2 pad | Tool | Genesee Scientific | 59-172 | |
| Benchtop Flowbuddy Complete System | Tool | Genesee Scientific | 59-122WCU | |
| Bubble Humidifier | Tool | Salter Labs | 7100 | |
| Ball filler needle | Tool | Genesee Scientific | 54-119 | |
| ¾” Label Tape | Supply | Fisher Scientific | 15-901-5B |
References
- Singh, S. R., Hou, S. X. Immunohistological Techniques for Studying the Drosophila Male Germline Stem Cell. Methods Mol Biol. 450, 45-59 (2008).
