Summary
Drosophila melanogaster Hoden können schnell und effizient von erwachsenen Männern mit Sezieren Nadeln isoliert. Mit etwas Übung kann man leicht in ein oder zwei Tage zu isolieren einen Betrag von Hoden reicht für die Analyse von DNA oder RNA, die im Hochdurchsatz-Sequenzierung oder eher traditionellen Methoden der Molekularbiologie oder der Protein-Antikörper-oder Enzym-Assays.
Abstract
Die Hoden von Drosophila melanogaster stellen ein wichtiges Modell für das Studium der Erhaltung von Stammzellen und Differenzierung, Meiose, und Soma-Keimbahn-Wechselwirkungen. Testes sind in der Regel von männlichen Erwachsenen 0-3 Tage nach dem Schlüpfen aus der Puppenhülle isoliert. Die Hoden von Wildtyp-Fliegen sind leicht von anderen Geweben zu unterscheiden, weil sie gelb sind, aber die Hoden aus weißem mutierte Fliegen, sind eine häufige genetische Hintergrund für Laborexperimente ähnlich in Form und Farbe, um die Fliege gut. Performing Dissektion auf einem Glasobjektträger mit einem schwarzen Hintergrund macht die Identifizierung der Hoden erheblich erleichtert. Hoden werden von den Fliegen mit Sezieren Nadeln entfernt. Im Vergleich zu Protokollen, die Zange verwenden für Hoden Dissektion, ist unsere Methode viel schneller, so dass ein eingespieltes Einzelnen Hoden 200 bis 300 Wildtyp-Fliegen pro Stunde zerlegen, wodurch 400-600 Hoden. Testes von weißen Fliegen oder von Mutanten, die Hoden verkleinern, sind schwerer zu sezieren und liefern typischerweise 200-400 Hoden pro Stunde.
Protocol
- Machen Sie einen Glasobjektträger mit einem schwarzen Hintergrund: Cut 20 # weißes Papier auf die gleiche Größe wie die Objektträger. Farbe der einen Seite der Folie-Papier schwarz mit einem Permanent-Marker (zB Sharpie). Bewerben Weißleim (Elmer), die schwarze Seite und halten das Papier auf die Folie. Die Folie kann wiederverwendet werden. Mit ¾ "Etikettenband (Fisherbrand), sichern Sie die Objektträger, Glas nach oben, um die CO 2-fly-Pad, um es zu fixieren.
- Sammeln Sie 0-3 Tage alten männlichen Fliegen.
- Bereiten Sie einen Eimer mit Eis, Kochsalzlösung (PBS), seziert Nadeln phosphatgepuffertes.
- Betäuben 50-100 fliegt mit einem Strom von CO 2 und übertragen Sie sie aus der Flasche oder Fläschchen-the-fly-Pad in der Nähe der Objektträger.
- Pipette ~ 50 ul eiskaltem PBS in einem Tropfen in der Mitte des Objektträgers.
- Gently abholen eine männliche Fliege mit dem Präpariernadel-dip die Präpariernadel in PBS, sanfte Berührung der Bauchseite (dh in der Nähe der Flügel) der Fliege mit der Nadel-Platz in die Tropfen PBS.
- Legen Sie eine Nadel auf die Mitte des zu fliegen, zwischen den Brustkorb und den Bauch, drücken Sie fest. Legen Sie die andere Nadel zwischen dem sechsten (A6) und siebten (A7) Abdominalsegmente (die zweite und dritte Streifen von unten); ziehen Sie den Bauch vom Brustkorb.
- Tease den Hoden von anderen Organen, vor allem im Darm. Besonders in weißen Mutanten, schauen Hoden und Darm ähnlich. Wesentliche Unterschiede sind, dass Hoden immer in Paaren, jeder Hoden hat eine spiralförmige Muster und ist in der Farbe weiß, als gut.
- Bewahren Sie die Hoden in eiskaltem PBS in einem Polypropylen-Mikrozentrifugenröhrchen.
Repräsentative Ergebnisse:
Abbildung 1. Dorsale Ansicht der männlichen Geschlechtsorgane, von flybase.org/reports/FBim0000074.html. FlyBase Zuordnung:... "Nach Abbildung 38 A auf Seite 508 aus Miller (1950) A. Miller Die innere Anatomie und Histologie der imago von Drosophila melanogaster In M. Demerec, Redakteur, Biologie von Drosophila, Kapitel 6, Seiten 420 - 534. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Faksimile-Ausgabe, 1994. Copyright 1994 von Cold Spring Harbor Laboratory Press. mit freundlicher Genehmigung von Cold Spring Harbor Laboratory (CSHL) Drücken verwendet. Siehe http://www.cshlpress.com . "
Discussion
Wir bieten ein Protokoll zum Hoden von ausgewachsenen männlichen Drosophila melanogaster zu isolieren. Da die Technik erfordert Koordination eigenen zwei Hände, Geschick geht nur mit der Praxis.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Autoren danken Vasia Vagin für die Einführung dieser Technik in unserem Labor.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting needle | Tool | Fisher Scientific | S17346 | |
| Micro Slides, Plain | Tool | Fisher Scientific | 12-553 | |
| Microscope Light | Tool | Schott AG | KO-1500 | |
| CO2 pad | Tool | Genesee Scientific | 59-172 | |
| Benchtop Flowbuddy Complete System | Tool | Genesee Scientific | 59-122WCU | |
| Bubble Humidifier | Tool | Salter Labs | 7100 | |
| Ball filler needle | Tool | Genesee Scientific | 54-119 | |
| ¾” Label Tape | Supply | Fisher Scientific | 15-901-5B |
References
- Singh, S. R., Hou, S. X. Immunohistological Techniques for Studying the Drosophila Male Germline Stem Cell. Methods Mol Biol. 450, 45-59 (2008).
