Summary
Dit artikel beschrijft een elektrofysiologische methode voor het isoleren van chemische stimulatie aan individuele sensilla via extracellulaire, tip-opnames onder minerale olie.
Abstract
Beschrijven we een wijziging van een bestaande tip-opnametechniek 1,2 voor elektrofysiologische onderzoeken van korte, peg-achtige zintuiglijke sensilla 3,4. Op het midden van de ventrale oppervlak van alle schorpioenen zijn twee aanhangsels genoemd pectines, die dichte velden van zijn mechanisch-en chemosensory peg sensilla 5,6. Een methode voor het beoordelen van chemoresponsiveness van deze sensilla maakt gebruik van een wolfraam elektrode voor extracellulair het opnemen van neurale activiteit in een sensillum als een vluchtig odorant is ingevoerd om het zintuiglijke veld 5,7. De beperkingen van deze methode zijn langzame verzamelen van gegevens en ongecontroleerd stimulerende kennismaking met, en de uitslag uit het peg veld. Om deze beperkingen, ontwikkelden we een nieuwe tip-opname techniek die niet-polaire minerale olie gebruikt als een medium om op basis van water tastants te leveren aan de individuele pin sensilla 8,9. We hebben met succes deze methode toegepast op sensillar chemoresponses verkrijgen om citroenzuur, ethanol, en zout. Hier beschrijven we de experimentele protocol voor een dergelijke studie 9. We denken dat deze nieuwe methode kan nuttig zijn voor het bestuderen van de respons-eigenschappen van andere geleedpotigen chemosensory systemen, waaronder die van insecten 10, 11 en schaaldieren 12.
Protocol
1. Pre-registratie, Live Animal Voorbereiding
- Haal de schorpioen uit zijn huis pot en plaats deze in een pre-gekoeld glas container, naast, plaats de pot met de schorpioen in een bevriezing omgeving (-5 ° C) voor een minimum van twee minuten. Deze tijd kan variëren afhankelijk van de leeftijd, grootte, soort, enz. van de specifieke schorpioen onder studie. Maar in het algemeen, is het bevriezen omgeving fase is afgerond zodra het dier is onbeweeglijk.
- Na twee minuten, verwijder de geïmmobiliseerde schorpioen uit het koude glas container, en plaats het ventrale zijde naar boven op een microscoopglaasje. Zet de stinger, staart, benen en pedipalpen met vormbaar klei (op basis van olie, Van Aken Plastalina).
- Maak een platform waarop de schorpioen pectinen te zetten. Pas het platform lengte en breedte volgens de grootte van de Pecten. Meestal worden onze platformen opgebouwd uit microscoop te dekken glas en zijn ongeveer 10 (L) X 18 (W) mm.
- Hechten dubbelzijdige tape om de Pecten platform, het bijknippen van de tape (indien nodig) te passen.
- Om een pectinal kamer, zet drie van de vier van het platform zijkanten in de pre-gesmolten was (we gebruiken 100% bijenwas chips) tot een diepte van 3-4 mm. We smelten de was door het plaatsen van de chips in een glazen petrischaal, gelegen op een hete plaat. Zodra de wax op de randen van de pectinal kamer is afgekoeld tot kamertemperatuur, zou dit tot muren van wax ongeveer 1 mm hoog.
- Op het dier, zoekt u de punt van pectinal inbrengen, en plaats de niet-gewaxt rand van het platform (tape side-up) juist achter aan. Daarna, het stabiliseren van de platform (zodat het niet zal bewegen later) door zachtjes te drukken op de rechter en linker omtreksranden tegen de klei wordt gebruikt om de dieren de benen te beperken.
- Gebruik fijne punt tang zorgvuldig plaats het pecten of pectinen in de kamer. In het bijzonder, met behulp van pincet, houdt u de pecten langs de pectinal ruggengraat, en voorzichtig breng het pecten uit onder de kap glas en zakken op de lijm vloer van het platform. Stel een Pecten-to-tape binding door voorzichtig druk uit te oefenen op de pectinal wervelkolom.
- Nu gelden gesmolten was (we gebruiken een voorverwarmde metalen spatel) bij het VN-gewaxt rand van het platform. Het doel is tweeledig, aan de Pecten veilige en volledig te omsluiten de kamer voor de toekomstige minerale olie introductie. Wees voorzichtig bij het toepassen van de was boven pecten van het dier, omdat het mogelijk is om schade aan de Pecten met was, dat is te warm.
- De Pecten kamer bouw is voltooid. Vervolgens oprichting van een indifferente elektrode verbinding met hemolymfe van het dier door het invoegen van een zilveren draad tussen twee staart segmenten.
2. Gelijktijdig opnemen en extracellulaire chemische stimulatie
- We bereiden het dier 24 uur voorafgaand aan het uitvoeren van extracellulaire, tip-opnames, waarin onder andere redenen (dat wil zeggen dieren aanpassing aan vaste positie), maakt het mogelijk de tijd om op maat te maken stimulerende pipetten van een specifieke (sensillum-afhankelijk) tip-diameter. We maken gebruik van een micropipet trekker voor het bereiken van dergelijke specificaties. Idealiter, de diameter van de pipetten is ≈ 2 micrometer groter is dan de sensillar porie diameter. We dienovereenkomstig aan te passen onze micropipet specificaties voor elk dier.
- 1 uur voorafgaand aan de opname, voegen we 5 pi van minerale olie aan de pectinal kamer, onderdompelen van het pecten onder olie. Vervolgens hebben we de positie van de dieren onder een krachtige microscoop, die al lange tijd werkafstand doelstellingen en epi-verlichting.
- Chemisch stimuleren peg sensilla, introduceren we waterige tastants (dat wil zeggen citroenzuur en zout) door de olie medium. Eerst maken we gebruik van een micropipet vulmiddel voor de stimulerende injecteren in de stimulerende pipet. Let op: alle stimulerende oplossingen moeten een elektrolyt voor de elektrische geleiding bevatten.
- Vervolgens na het positioneren van de stimulerende pipet op een micromanipulator (in de opname rig), plaatst u de opname elektrode in de stompe, open einde van de stimulerende pipet. Het is belangrijk om ervoor te zorgen contact tussen de metalen elektrode en elektrolytische stimulerende oplossing.
- Als de voorbereiding is elektrisch geaard zijn (via de indifferente elektrode), doen dalen de pipet door de olie-medium en op een sensillar porie. De duur van de chemische stimulatie per pectinal sensillum kan variëren van zo veel als dertig minuten om zo weinig als een seconde. In het algemeen kunnen we genieten van meerdere pinnen (> 30) per pipet. In het geval dat de stimulerende pipet verstopt raakt met de minuut puin, gewoon wisselen de verstopte pipet voor een nieuwe, ongebruikte pipet.
3. Het opstellen van een dier voor meerdere dagen van Experimentation
- Als het dier kan worden gebruikt over een langere periode, raden wij aan hergebruik van de pectinal kamer en het vervangen van de daling van minerale olie voor elke opname sessie. Na een bepaalde dag van de opname sessie is voltooid, verwijdert u het dier uit de opname set-up en het uitvoeren van een minerale olie wassen.
- Specidelen die specifiek, nog een druppel (5 pl) van minerale olie naar de kamer, en verwijder alle olie. Dit helpt het minimaliseren van de aanwezigheid van resten van stimulerende, die kunnen hebben gelekt van de pipet tijdens de opname sessie.
- Voordat de volgende sessie, voeg een druppel olie zoals eerder beschreven.
4. Representatieve resultaten:
Afhankelijk van de opname apparatuur die wordt gebruikt (bijvoorbeeld de bijzondere versterker, het digitaliseren van hardware, enz.), een vertegenwoordiger resultaat is een extracellulaire met een S: N-verhouding van minimaal 3:1.
Succesvolle bouw van de minerale olie kamer is noodzakelijk voor het isoleren van chemische stimulatie aan individuele sensilla, omdat het een medium voor het leveren van polaire (op basis van water) chemische tastants 8. Als er te weinig olie of helemaal geen, zal het stimulerende oplossing verspreid van de opgenomen sensillum naar de aangrenzende sensilla, die waarschijnlijk een langdurige, ongecontroleerde aanval van chemische stimulatie 8 veroorzaken.
Discussion
Het protocol hiervoor wordt beschreven hoe u een woestijn grasland schorpioen (Paruroctonus utahensis) voor te bereiden op elektrofysiologische studie. In het bijzonder laten we zien hoe je een kamer voor gecontroleerde extracellulaire tip-opnames van pectinal chemosensory neuronen onder de olie op te bouwen. Omdat olie en water niet mengen niet, is het mogelijk te isoleren chemische stimulatie (met water op basis van stimulerende middelen) om een sensilla. Benadrukt moet worden dat P. utahensis, is een relatief klein dier (≈ 2,5 tot 5 cm) en het toepassen van dit protocol om grotere dieren kunnen vereisen veel aanpassingen van grootte, zoals de grootte van het platform van het dier, kamermuziek, en de hoeveelheid olie toegepast. We raden aan het uitvoeren van pilot-studies aan de minimum hoeveelheid olie nodig is voor gecontroleerde afgifte van water-gebaseerde chemische stimulerende middelen te testen.
Verder vonden we geen effect van olie op de baseline neurale activiteit binnen pectinal sensilla 8. Dit moet worden bevestigd voor andere model systemen ook, voorafgaand aan het beoordelen van chemoresponsiveness.
Deze methode kan worden gebruikt in combinatie met een andere methode om te testen op chemoresponse interactie-effecten tussen sensilla in de sensorische veld. Bijvoorbeeld, is het mogelijk om tip-record (onder olie) uit een sensillum als we base-record (via een wolfraam elektrode) uit een naburig sensillum 9. Zo'n opname configuratie kan worden gebruikt om te beoordelen al dan niet chemisch te stimuleren een sensillum invloed op de neurale activiteit van de basis opgenomen sensillum. Tot op heden heeft niemand dit getest voor schorpioen pectinal sensilla, en het blijft een open vraag voor andere chemosensory systemen.
Om samen te vatten, denken we dat de tip-opname methode onder olie bevordert de omvang van elektrofysiologische onderzoek naar de neurale basis van geleedpotigen het proeven. In dit manuscript, bieden we een protocol voor het bereiden van dieren voor deze methode, en we hopen dat het zorgt voor een stevige basis voor verdere studie van perifere sensorische zenuwstelsels.
Disclosures
We hebben eerder gepubliceerde deze methoden in twee tijdschriften, Knowlton en Gaffin (2009) en Knowlton en Gaffin (in press).
Acknowledgments
We bedanken de LIFE-fonds, de Universiteit van Oklahoma Undergraduate Research Program kansen, en de afdeling Zoölogie voor de financiering van dit werk. We danken ook dr. Mariëlle Hoefnagels voor redactionele hulp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lift-N-Press tab | Ted Pella, Inc. | 16082 | Doubled-sided adhesive |
| MicroFil | World Precision Instruments, Inc. | MF34G | Micropipette filler |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-6 | Glass pipettes |
| Micr–lectrode Holder | World Precision Instruments, Inc. | MEH3SBW10 |
References
- Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. Physiology of a Primary Chemoreceptor unit. Science. 12, 417-418 (1955).
- Newland, P. L. Taste processing in the insect nervous system. Methods in Insect Sensory Neuroscience. Christensen, T. A. , CRC Press. Boca Raton. 289-318 (2005).
- Foelix, R. F., Müller-Vorholt, G. The fine structure of scorpion sensory organs II. Pecten sensilla. Bull. Br. Arachnol. Soc. 6, 68-74 (1983).
- Carthy, J. D. Fine structure and function of the sensory pegs on the scorpion pecten. Experientia. 22, 89-91 (1966).
- Gaffin, D. D., Brownell, P. H. Response properties of chemosensory peg sensilla on the pectines of scorpions. J. Comp. Physiol. A. 181, 291-300 (1997).
- Wolf, H. The pectine organs of the scorpion, Vaejovis spinigerus: Structure and (glomerular) central projections. Arthropod Struct. Dev. 37, 67-80 (2008).
- Gaffin, D. D., Brownell, P. H. Electrophysiological evidence of synaptic interactions within chemosensory sensilla of scorpion pectines. J. Comp. Physiol. A. 181, 301-307 (1997).
- Knowlton, E. D., Gaffin, D. D. A new approach to examining scorpion peg sensilla: the mineral oil flood technique. J. Arachnol. 37, 379-382 (2009).
- Knowlton, E. D., Gaffin, D. D. A new tip-recording method to test scorpion pecten chemoresponses to water-soluble stimulants. J. Neurosci Methods. , Forthcoming Forthcoming.
- Haupt, S. S. Antennal sucrose perception in the honey bee (Apis mellifera L.): behaviour and electrophysiology. J. Comp. Physiol. A. 190, 735-745 (2004).
- Bland, R. G. Sensilla on the antennae, mouthparts, and body of the larva of the alfalfa weevil, hypera postica (gyllenhal) (Coleoptera : Curculionidae). Int. J. Insect Morphol. Embryol. 12, 261-272 (1983).
- Cate, H. S., Derby, C. D. Hooded Sensilla Homologues: Structural Variations of a Widely Distributed Bimodal Chemomechanosensillum. J. Comp. Neurol. 444, 345-357 (2002).
