Summary
В этой статье описывается электрофизиологических метод выделения химической стимуляции отдельных сенсилл через внеклеточный, зонд-записей под минеральным маслом.
Abstract
Мы опишем модификацию существующих зонд-записи технику 1,2 для электрофизиологически расследование Короче говоря, ПЭГ-как сенсорно сенсилл 3,4. В середине вентральной поверхности всех скорпионов два придатками называется пектиновые вещества, которые имеют плотные области механо-и хемосенсорных колышек сенсилл 5,6. Одним из методов оценки chemoresponsiveness этих сенсилл использует вольфрамовый электрод для внеклеточно записи нейронной активности в сенсиллы как летучие одоранта вводится сенсорные поля 5,7. Ограничения этого метода включают медленный сбор данных и неконтролируемого введения стимулятора, и снятие с, поле привязки. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы разработали новый наконечник записи техника, которая использует неполярных минеральное масло, как среда, через которую доставить на водной основе tastants отдельным колышек сенсилл 8,9. Мы успешно применяли этот метод для получения sensillar chemoresponses к лимонная кислота, этанол, и соль. Здесь мы опишем экспериментальный протокол для такого исследования 9. Мы считаем, что новый метод может оказаться полезным для изучения ответа свойства других членистоногих хемосенсорных систем, в том числе и насекомых, 10, 11 и ракообразных 12.
Protocol
1. Предварительная запись, Live Подготовка животных
- Удалить скорпиона из своего банка и поместить его в предварительно охлажденный бокал контейнер, а рядом, место сосуде скорпиона в среде замораживания (-5 ° С) в течение не менее двух минут. Это время может варьироваться в зависимости от возраста, размеров, видов и т.д. конкретных скорпиона в стадии изучения. Но в целом, замораживания фазы среды завершения один раз животное неподвижно.
- После двух минут, снимите иммобилизованных скорпиона от холода тарного стекла, и поместить его брюшной стороне на предметное стекло. Безопасные жало, хвост, ноги и педипальпы с формовочной глины (на масляной основе, Ван Акен Plastalina).
- Сделать платформу, на которой поставить пектины скорпиона. Отрегулируйте длину платформы и ширины в зависимости от размера гребень. Как правило, наши платформы построены из стекла микроскопа крышкой и примерно 10 (L) x 18 (Ш) мм.
- Придерживайтесь двусторонней клейкой ленты, чтобы гребень платформы, обрезки ленты (при необходимости), чтобы соответствовать.
- Для того, чтобы pectinal камеры, положите три-четыре платформы сторон в предварительно расплавленный воск (мы используем 100% пчелиного воска чипов) на глубину 3-4 мм. Мы расплавить воск, помещая фишки в стеклянном блюде Петри, расположенный на горячей плите. Как только воск по краю pectinal камеры охлаждается до комнатной температуры, это должно создать стены воска около 1 мм.
- На животных, найдите точку pectinal вставки, и место не-воском края платформы (лента стороной вверх) как раз позади него. Потом, стабилизировать платформу (так, чтобы она не будет двигаться в дальнейшем), слегка нажав ее правую и левую периферические края против глина, используемая удержать ноги животного.
- Используйте с острым концом щипцов тщательно место гребне или пектиновые вещества внутри камеры. В частности, используя щипцы, держать гребень вдоль pectinal позвоночник, и плавно довести гребень из-под покровного стекла и опустите его на пол клей платформы. Создание гребень-лента облигаций тщательно давления на pectinal позвоночника.
- Теперь нанесите расплавленный воск (мы используем предварительно раскаленного металла шпателем) для не-воском краю платформы. Цели в два раза, чтобы обеспечить гребне и в полной мере приложить камера для будущего введения минеральных масел. Соблюдайте осторожность при применении воска на гребень животного, так как можно повредить гребень с воском, который является слишком жарко.
- Гребне Строительной палаты является полным. Далее, установить связь равнодушным электрод с гемолимфы животного путем введения серебряной проволоки между двумя сегментами хвост.
2. Одновременная запись внеклеточной и химической стимуляции
- Мы готовим животных 24 ч до проведения внеклеточной, наконечник-записи, которая, среди прочих причин (т.е. животное корректировки фиксированном положении), позволяет вовремя сделать заказ стимулятор пипеток конкретные (сенсиллы-зависимый) наконечник диаметра. Мы используем микропипетки съемник для достижения таких характеристик. В идеале, диаметр пипетки составляет ≈ 2 мкм больше, чем диаметр пор sensillar. Мы корректируем наши спецификации микропипетки, соответственно, для каждого животного.
- 1 ч до начала записи, мы добавляем 5 мкл минерального масла для pectinal камере, погружая гребне под масла. Затем, мы позиционируем животных под мощным микроскопом, который имеет большое рабочее расстояние цели и эпи-подсветкой.
- Для химически стимулировать колышек сенсилл, введем водных tastants (например, лимонной кислоты и соли) с помощью масляной средой. Во-первых, мы используем микропипетки наполнителя для введения стимулятора в стимулятором пипетки. Примечание: все стимулятором решения должна содержать электролита для электрической проводимости.
- Далее, после позиционирования стимулятор пипетки на микроманипулятора (в записи установки), вставить электрод в записи тупые, открытый конец стимулятор пипетки. Важно, чтобы обеспечить контакт между металлическим электродом и раствором электролита стимулятор.
- Как только препарат заземлены (через индифферентный электрод), просто понизить пипетки через масляной средой и на пор sensillar. Продолжительность химическое раздражение в pectinal сенсиллы может варьироваться от целых тридцать минут до всего лишь одну секунду. Как правило, мы можете попробовать несколько колышков (> 30) в пипетку. В случае, если стимулятор пипетки забивается мусором минуту, просто обмен забитые пипетки для новых, неиспользованных пипетки.
3. Подготовка животных для нескольких дней эксперименты
- Если животное будет использоваться в течение длительного периода времени, рекомендуется повторно pectinal камеры и заменить каплю минерального масла на каждой сессии записи. После записи сессии данный день является полным, удалить животное от записи настройки и выполнять мыть нефтепродуктов.
- Specifically, добавьте еще одну каплю (5 мкл) минерального масла в камеру, и удалить все масло. Это помогает свести к минимуму наличие остаточных стимулятор, которые, возможно, утечка из пипетки во время записи сессии.
- До следующей сессии, добавьте одну каплю масла, как описано выше.
4. Представитель Результаты:
В зависимости от записи используемого оборудования (например, конкретный усилитель, оцифровка оборудование и т.д.), представитель результате внеклеточная записи с S: шум, по крайней мере 3:1.
Успешное строительство камеры минеральное масло необходимо для выделения химической стимуляции отдельных сенсилл, поскольку это обеспечивает среду для доставки полярных (на водной основе) tastants химических 8. Если есть слишком мало нефти, или вообще, стимулятор решение будет распространяться от записанного сенсиллы в соседних сенсилл, который может вызвать длительный, неконтролируемый приступ химическое раздражение 8.
Discussion
Протокол выше описано, как подготовить пастбища пустыни скорпиона (Paruroctonus utahensis) для электрофизиологических исследований. В частности, мы покажем, как построить камеру для контролируемых внеклеточной зонд-записи pectinal хемосенсорных нейронов под масла. Потому что нефть и вода не смешиваются, можно выделить химическое раздражение (на водной основе стимуляторы) выделить сенсилл. Следует подчеркнуть, что П. utahensis, является относительно небольшое животное (≈ 2,5-5 см) и применяя этот протокол для более крупных животных может потребовать много корректировки размера, например, размер платформы животного, камеры, и количество масла применяются. Мы рекомендуем проводить экспериментальные исследования для тестирования минимальное количество масла необходимо для контролируемой доставки на водной основе химических стимуляторов.
Кроме того, мы не обнаружили влияния нефти на базовых нейронной активности в pectinal сенсилл 8. Это должно быть подтверждено и для других модельных систем, а также, до оценки chemoresponsiveness.
Этот метод может быть использован в сочетании с другим методом, чтобы проверить на chemoresponse эффекты взаимодействия между сенсилл сенсорной области. Например, можно дать чаевые-запись (под масло) из одного сенсиллы как мы базовой записи (через вольфрамовым электродом) из соседних сенсиллы 9. Такие записи конфигурации могут быть использованы для оценки того или нет, химически стимулирующие один сенсиллы влияет на нейронную активность базы записанные сенсиллы. На сегодняшний день, никто его не тестировал это для скорпиона pectinal сенсилл, и он остается открытым вопросом для других хемосенсорных систем.
Подводя итог, мы считаем, что зонд-метод записи под маслом достижений сферы электрофизиологические исследования на основе нейронных членистоногих дегустация. В этой рукописи, мы предоставляем протокол для подготовки животных для этого метода, и мы надеемся, что он обеспечивает прочную основу для дальнейшего изучения периферических сенсорных нервных систем.
Disclosures
Ранее мы опубликовали эти методы в двух журналах, Knowlton и Gaffin (2009) и Knowlton и Gaffin (в печати).
Acknowledgments
Мы благодарим Жизнь фонд, Университет штата Оклахома Бакалавриат Исследования возможностей программы, а также кафедры зоологии для финансирования этой работы. Мы также благодарим доктора Мариэль Hoefnagels по редакционным помощь.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lift-N-Press tab | Ted Pella, Inc. | 16082 | Doubled-sided adhesive |
| MicroFil | World Precision Instruments, Inc. | MF34G | Micropipette filler |
| Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-6 | Glass pipettes |
| Micr–lectrode Holder | World Precision Instruments, Inc. | MEH3SBW10 |
References
- Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. Physiology of a Primary Chemoreceptor unit. Science. 12, 417-418 (1955).
- Newland, P. L. Taste processing in the insect nervous system. Methods in Insect Sensory Neuroscience. Christensen, T. A. , CRC Press. Boca Raton. 289-318 (2005).
- Foelix, R. F., Müller-Vorholt, G. The fine structure of scorpion sensory organs II. Pecten sensilla. Bull. Br. Arachnol. Soc. 6, 68-74 (1983).
- Carthy, J. D. Fine structure and function of the sensory pegs on the scorpion pecten. Experientia. 22, 89-91 (1966).
- Gaffin, D. D., Brownell, P. H. Response properties of chemosensory peg sensilla on the pectines of scorpions. J. Comp. Physiol. A. 181, 291-300 (1997).
- Wolf, H. The pectine organs of the scorpion, Vaejovis spinigerus: Structure and (glomerular) central projections. Arthropod Struct. Dev. 37, 67-80 (2008).
- Gaffin, D. D., Brownell, P. H. Electrophysiological evidence of synaptic interactions within chemosensory sensilla of scorpion pectines. J. Comp. Physiol. A. 181, 301-307 (1997).
- Knowlton, E. D., Gaffin, D. D. A new approach to examining scorpion peg sensilla: the mineral oil flood technique. J. Arachnol. 37, 379-382 (2009).
- Knowlton, E. D., Gaffin, D. D. A new tip-recording method to test scorpion pecten chemoresponses to water-soluble stimulants. J. Neurosci Methods. , Forthcoming Forthcoming.
- Haupt, S. S. Antennal sucrose perception in the honey bee (Apis mellifera L.): behaviour and electrophysiology. J. Comp. Physiol. A. 190, 735-745 (2004).
- Bland, R. G. Sensilla on the antennae, mouthparts, and body of the larva of the alfalfa weevil, hypera postica (gyllenhal) (Coleoptera : Curculionidae). Int. J. Insect Morphol. Embryol. 12, 261-272 (1983).
- Cate, H. S., Derby, C. D. Hooded Sensilla Homologues: Structural Variations of a Widely Distributed Bimodal Chemomechanosensillum. J. Comp. Neurol. 444, 345-357 (2002).
