Summary
Den subcellulära lokalisering av proteiner är viktigt för att bestämma tid och rum reglering av cellsignalering. Här beskriver vi bimolecular fluorescens komplettering (BiFC) som en enkel metod för att övervaka den rumsliga interaktioner mellan proteiner i cellen.
Abstract
Definiera subcellulära fördelningen av signalering komplex är absolut nödvändigt för att förstå resultaten från den komplexa. Konventionella metoder som immunoprecipitation ger ingen information om den rumsliga lokaliseringen av komplex. Däremot övervakar BiFC samspelet och subcellulära uppdelning av proteinkomplex. I denna metod är en fluororescent protein delas upp i amino-och karboxi-terminal icke fluorescerande fragment som sedan smält till två proteiner av intresse. Växelverkan mellan proteiner resulterar i beredning av fluoroforen (Figur 1) 1,2. En begränsning av BiFC är att när den fragmenterade fluoroforen löses komplexet är oåterkallelig 3. Denna begränsning är en fördel i att upptäcka flyktiga eller svag växelverkan, men utesluter en kinetisk analys av komplexa dynamik. En extra varning är att den rekonstituerade flourophore kräver 30min att mogna och fluorescerar, återigen utesluter observation av realtid interaktioner 4. BiFC är ett konkret exempel på det protein fragment komplettering analys (PCA) som sysselsätter reporter proteiner såsom grönt fluorescerande protein varianter (BiFC), dihydrofolatreduktas, B-betalaktamas och luciferas att mäta protein: protein interaktioner 5,6. Alternativa metoder för att studera protein: protein interaktioner i celler inkluderar fluorescens co-lokalisering och Förster resonans energiöverföring (FRET) 7. För co-lokalisering, är två proteiner individuellt märkta antingen direkt med en fluoroforen eller genom indirekt immunofluorescens. Leder dock detta sätt att hög bakgrund av icke-interagerande proteiner vilket gör det svårt att tolka co-lokalisering data. Dessutom, på grund av gränserna för upplösning konfokalmikroskopi kan två proteiner som visas samarbete lokaliserad utan att nödvändigtvis interagera. Med BiFC är fluorescens endast observerats när de två proteiner av intresse interagerar. FRET är en annan utmärkt metod för att studera protein: protein interaktioner, men kan vara tekniskt utmanande. FRET experiment kräver givare och acceptanten vara av liknande ljusstyrka och stökiometri i cellen. Dessutom måste ett konto för blöda igenom av givaren i acceptanten kanalen och vice versa. Till skillnad från FRET har BiFC lite bakgrundsfluorescens, lite efterbearbetning av bilddata, inte kräver hög överuttryck, och kan upptäcka svaga eller transienta interaktioner. Bioluminescence resonans energy transfer (BRET) är en metod som liknar FRET utom givaren är ett enzym (t ex luciferas) som katalyserar ett substrat för att bli självlysande och därmed spännande en acceptor. BRET saknar de tekniska problemen vid blöda igenom och hög bakgrundsfluorescens men saknar förmåga att tillhandahålla geografisk information på grund av bristen av substrat lokalisering till specifika fack 8. Sammantaget är BiFC en utmärkt metod för att visualisera subcellulära lokalisering av proteinkomplex att få insikt i compartmentalized signalering.
Protocol
A. BiFC Kalibrering
- Välj ett fluoroforen. Det finns flera fluoroforer, såsom YFP och Venus, som fungerar bra som BiFC fusion partner (tabell 1). Amino-och karboxi-terminal ändarna av Venus kan bilda ett komplex vid 37 ° C, medan YFP BiFC fragmenten kräver en pre-inkubation vid 30 ° C för att underlätta fluoroforen bildning 2. Detta inkubation vid en låg temperatur kan förändra en del cellulära processer och bör beaktas vid val av fragment. Vektorer för fusing Venus till karboxi-ändstationen av proteiner finns tillgängliga från Addgene ( http://www.addgene.org/pgvec1 ; seepBiFC-VN173 och pBiFC-VC155) tillsammans med ytterligare konstruktioner för att användas som kontroller, t.ex. pBiFC-bJunVN173 och pBiFC-bFosVC155 2. Ytterligare vektorer, inklusive amino-terminal Venus vektorer (pFLAG-VN173 och PHA-VC155), finns på följande webbplats: http://people.pnhs.purdue.edu/ ~ hu1 / .
- Tag proteinet av intresse. BiFC fragmenten smält till amino-eller karboxi-terminal ändarna av kandidaten proteiner. Vissa proteiner kan inte tillåta att märkning i vardera änden på grund av störningar av proteiners funktion. Till exempel har många medlemmar i Ras superfamiljen av GTPases är lipid ändras på karboxi-terminalen vilket således innebär att infästning av BiFC fragment i detta syfte. Därför är det viktigt att ha en uppfattning om hur fastsättning av BiFC fragment kan påverka funktionen hos proteiner av intresse. Om det är oklart hur märka ett protein kommer att påverka dess funktion flera kombinationer bör testas. Förutom de BiFC fragment kan en peptid länkaren tas med för att öka flexibiliteten mellan de fragmentariska fluoroforen och de proteiner som kandidat. Medan flera kloning webbplatser (MCS) i BiFC vektorer koda korta aminosyra sträckor som kan ge tillräcklig flexibilitet, RSIAT, KQKVMNH och RPACKIPNDLKQKVMNH länkare har framgångsrikt använts i BiFC experiment 3,9
- Bestäm transfektion förhållanden. Innan testa flera mutanter, bör ett fåtal kontroll experiment utföras. De två första BiFC kombinationer som bör prövas är två vildtyp proteiner som är kända för att interagera och en vildtyp och mutant som inte samverkar. Med hjälp av dessa två kombinationer, bör olika mängder DNA och tider transfektion provas för att fastställa optimala förhållanden för att upptäcka en BiFC signal för kandidaten proteiner. Vi föreslår tester 0.25ug, 0.5ug, 1.0ug av varje BiFC bygga för en brunn i en 6 bra maträtt. Dagen efter celler transfektion bildskärmen genom fluorescensmikroskopi för att bestämma optimal tidpunkt för signal utveckling. Den pBiFC-bJunVN173 och pBiFC-bFosVC155 2 konstruktioner är användbara positiva kontroller för BiFC och är tillgängliga från Addgene (se ovan). Dessutom bör Western blot-analys utföras för att bekräfta lika uttryck för konstruktioner. Villkor bör väljas så att en fluorescerande signal observerades mellan de två vildtyp proteiner, men liten eller ingen signal observeras mellan vildtyp och muterade proteiner. Slutligen är det bäst att hålla proteinuttryck så lågt som möjligt för att förhindra icke-specifika interaktioner.
- Avgöra om tillägg av BiFC fragment förändrar lokalisering av proteiner av intresse. Varje BiFC konstruera innehåller antingen en HA eller flagga epitop tagg. Immunostain transefected celler för både HA eller flagga epitop tagg samt väl endogena proteinet (om möjligt) för att avgöra om BiFC taggen påverkar lokalisering av proteiner av intresse.
B. Plating och transfektion av celler
- COS celler (1.3x10 5) är pläterade var på ett glas botten Matek platta och två brunnar i ett 6-brunnar per prov. Låt celler till sig under natten vid 37 ° C. Alternativa celltyper som är mer relevanta för kandidat proteiner av intresse kan också användas.
- Förbered DNA för transfektion. Vi använder vanligtvis Lipofectamine (Invitrogen) för COS transfections. Dock kan andra reagenser vara mer lämplig för den cellinje av intresse. Eftersom transfektion blandningen kommer att delas mellan ett glas botten fat och två brunnar i ett 6-brunnar, använd lämplig mängd DNA till svars för denna uppdelning. Späd DNA i 250uL av serum gratis (SF) DMEM. Lägg fiskeripolitiken på 1 / 5 av beloppet av de totala BiFC DNA som transfektion kontroll. För BiFC kvantifiering kommer endast celler som är positiva för den gemensamma fiskeripolitiken ska analyseras för förekomst av en BiFC signal. Observera att den gemensamma fiskeripolitiken spektra kommer att överlappa med några av de BiFC par i tabell 1, och därför en alternativ transfektion kontrollkanske behövs. Späd Lipofectamine i 250uL SF DMEM (10uL Lipofectamine/1ug av DNA). Blanda DNA och spädningar Lipofectamine. Inkubera vid rumstemperatur i 20 minuter.
Obs: Lipofectamine: DNA förhållandet kan variera beroende på celltyp. Använd lämplig transfektion metod för cellinje av intresse. - Skölj celler 2x med varm SF DMEM. Tillsätt 2 ml av SF DMEM till varje glas bottenplatta eller brunn på en 6-bra maträtt.
- Dela varje transfektion blandningen jämnt mellan ett glas botten fat och två brunnar i ett 6-bra maträtt.
- Inkubera cellerna vid 37 ° C 5hrs.
- Ta transfektion media och ersätt med kompletta media (DMEM 10% FBS).
- Inkubera cellerna över natten vid 37 ° C. Längden på inkubation efter transfektion varierar beroende på uttrycket nivåer av de proteiner av intresse. Långvarig inkubering kan resultera i icke-specifik interaktion så detta steg måste bestämmas empiriskt.
C. Beredning av celler för Imaging
- Celler är initialt undersöks under ett epifluorescent mikroskop för att se till att den positiva kontrollen är fluorescerande. Om inte, kan det vara nödvändigt att ge cellerna ytterligare tid vid 37 ° C tills signalen observeras.
- Skölj celler 3x med PBS (pH 7,4). Till cellerna i glaset nedre skålen lägger 2% paraformaldehyd (pH 7,4). Fix celler för 10min på is. Skölj celler 3x med PBS (pH 7,4). Förvara cellerna vid 4 ° C täckt med 1 mL PBS (pH 7,4). Cellerna behöver inte fastställas för bildbehandling, men när BiFC fragment reformen en intakt fluoroforen den är oåterkallelig och därmed förhindra analys av dynamiska interaktioner 3. Håll också i minnet att ofixerade celler kommer att fortsätta att utveckla signal. Lyse cellerna i 6-bra maträtt och förbereda lysates för Western blot analys. Det är viktigt att alla celler är beredda på samma gång så att lyserade cellerna är representativa för avbildas celler.
D. Imaging Celler
- Fluorescensintensiteten kommer att beräknas per cell. Var noga med att avbilda enskilda celler.
- Gemensamma fiskeripolitiken ingår som en tranfection kontroll och endast gemensamma fiskeripolitiken positiva celler väljs för analys av BiFC signaler. Vi gör antagandet att om cellen är transfererats med den gemensamma fiskeripolitiken är det också transfererats med BiFC konstruktioner. Detta tillvägagångssätt säkerställer att avbildas celler som saknar en BiFC signal är negativa på grund av brist på ett samspel mellan proteiner av intresse och inte beror på avsaknad av en eller båda BiFC konstruktioner uttryck i den cellen.
- Vi använder en Zeiss LSM 510 konfokalmikroskop för cell imaging. När du använder denna mikroskop är det viktigt att hålla zooma, hål, detektor förstärkning, förstärkare offset, ramstorlek, skanningshastighet, skanna genomsnitt och lasereffekt konsekvent. När du använder Imaging System är det viktigt att behålla inställningar konstant så att fluorescensen är jämförbar mellan proven. Dessutom, när kvantifiera fluorescens är det viktigt att pixlarna inte är mättade.
E. Kvantifiera Fluorescens
- Fluorescens kan kvantifieras med hjälp av någon programvara för bildbehandling. Vi använder ImageJ som är fritt tillgängligt från NIH (http://rsb.info.nih.gov/ij/). Öppna bildfiler i ImageJ. Gå till AnalyzeSet mätningar. Markera rutorna för området och Mean Gray Värde i Mått rutan.
- Med hjälp av "fria handen urval" verktyg, rita en kontur runt kanten på hela cellen i den gemensamma fiskeripolitiken kanal.
- Lämnar denna översikt på plats, växla till YFP kanal. Gå till AnalyzeMeasure.
Mean Gray Värdet är summan av de grå värden av alla pixlar i markeringen dividerat med antalet pixel (dvs. den genomsnittliga fluorescensintensitet per område i cellen). - För varje bild rita en cirkel i YFP kanal i ett område som inte innehåller en cell. Ta ett mått för detta område som bakgrund. Subtrahera bakgrund från varje bild.
- Genomsnittlig Mean Gray minus bakgrunden för alla celler avbildas i ett prov. Detta kommer att vara den genomsnittliga fluorescensintensiteten för en befolkning på celler. Vi föreslår ca 60 celler över tre experiment kvantifieras.
F. representativa resultat:
Vårt labb fokuserar på multi-domain byggnadsställningar protein, intersectin (ITSN) som interagerar med många proteiner som reglerar många biokemiska och signalvägar 10,11,12,13,14. ITSN innehåller två Eps15 homologi (EH) domäner, en spiral-lindad regionen och fem Src homologi 3 (SH3) domäner. Ju längre isoformen av ITSN innehåller också Dbl homologi (DH) och pleckstrin homologi (PH) domäner som agerar i samförstånd som guanin nukleotid utbyte faktor för Cdc42 15. Detta modulära struktur främjar protein: protein interaktioner och gör ITSN en idealisk kandidat för BiFC experiment. Den subcellulära lokalisering av ITSN kan ändra sitt bindande partners och därför förändra vägar regleras av ITSN (unpublished data). Nyligen har vårt laboratorium visat att ITSN reglerar neuronala överlevnad genom reglering av en ny klass II PI3K, PI3K-C2β 11. Den amino-terminal Pro-rika domän PI3K-C2β innehåller två bindningsställen för ITSN är SH3 domäner. Använda co-immunoprecipitation med ITSN och PI3K-C2β mutanter trunkering vi visat att ITSN är SH3A och SH3C domäner interagera med amino-terminal regionen PI3K-C2β. Därefter använde vi BiFC att visualisera subcellulära lokalisering av denna komplexa. ITSN var smält till amino-ändstationen av Venus (pFLAG-VN173) och PI3K-C2β konstruktioner smält till karboxi-ändstationen av Venus (PHA-VC155). Som en annan negativ kontroll, var en icke-specifik peptid smält till PHA-VC155. VN-ITSN och VC-PI3K-C2β bildade en BiFC komplex med en punktat distribution (Figur 2A, övre paneler). Mutationer i Pro-rika domän PI3K-C2β som stör samfällning av ITSN och PI3K-C2β minskade BiFC signalen (Figur 2A, lägre paneler) 11. Denna skillnad i BiFC signalen mellan ITSN och de två PI3K-C2β proteiner berodde inte på skillnader i proteinuttryck (Figur 2B).
. Figur 1 I BiFC är en fluoroforen (i detta fall Venus) delas upp i aminosyror (VN) - och karboxi (VC)-terminal slutar. Gavlarna är smält till två proteiner av intresse. När de två proteiner interagerar, VN och VC fragment omassocieras resulterar i beredning av fluoroforen och fluorescens på platser för interaktion. BiFC är ett konkret exempel på det protein fragment complementation analys (PCA) används för att mäta protein: protein interaktioner 5.
Figur 2. ITSN och PI3K-C2β bildar en BiFC komplex. A. VN-märkta ITSN gavs samtidigt tranfected med VC taggade-PI3K-C3β WT eller en prolin-rika domän mutant (PI3K-C2β-PA). ITSN och WT PI3K-C2β bildar ett komplex (grön). Fiskeripolitiken (röd) användes som en transfektion kontroll B. En Western blot utfördes för att demonstrera lika uttryck för konstruktioner. VC-märkta konstruktioner är HA-märkta.
Tabell 1. Det finns flera vektorer som är kompatibla med BiFC. YN155: 1-155aa av YFP, YC155: 155-238aa av YFP, YN173: 1-172aa av YFP, YC173, 173-238aa av YFP, VN155: 1-154aa av Venus, VC155: 155-238 av Venus, VN173: 1-172aa av Venus, VC173: 173-238aa av Venus, CN155 1-154aa av GFP; CC155 155-238aa av GFP, GN173: 1-172aa av GFP, CitN155: 1-155aa av Citrin, CitC155: 155-238aa av Citrin, CitN173: 1-172aa av Citrin, CitC173: 173-238aa av Citrin, CerN173: 1-172aa av Cerulean 2,3,9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
BiFC är en utmärkt metod för att visualisera protein: protein interaktioner i hela celler och bestämma subcellulära lokalisering av dessa komplex. Fördelarna med BiFC är att endast interagerar proteiner är fluorescerande, är övergående interaktioner stabiliserats, och efter bearbetning av bilddata är minimal. Två nackdelar med denna metod är mognaden tid för fluoroforen och oåterkallelig fluoroforen komplex. Enligt vissa program här oåterkallelig kan användas som en fördel. Till exempel kan man använda ett enzym och en aktivator av detta enzym i BiFC komplexa, vilket leder till konstitutiv aktivering. Man skulle då kunna bestämma vilka proteiner som rekryteras till denna komplexa. Dessutom tillåter oåterkallelig BiFC komplexa för identifiering av svaga eller transienta interaktioner. Ordentliga kontroller är viktiga för tolkningen av BiFC experiment. Tomma BiFC vektorer bör inte användas som kontroller som dessa reagens resultera i höga bakgrundsfluorescens. Ordentliga kontroller inkluderar användning av en mutation i en av de proteiner av intresse som är känd för att blockera interaktionen mellan två proteiner. En icke-närstående protein som inte bör komplex med protein av intresse kan också användas. Det är också viktigt att Western blot-analys utförs för att säkerställa att uttryck av olika konstruktioner är lika och att skillnader i fluorescerande signal inte beror på olika nivåer av protein uttryck. Hög uttryck kan också leda till icke-specifika interaktioner och fluorescens, alltså uttryck nivåer bör hållas relativt låg.
BiFC är en praktisk metod som lätt kan kombineras med andra fluorescerande tekniker. Till exempel kan BiFC kombineras med standard immunofluorescens co-lokalisering för att undersöka trimolecular komplex trots att detta tillvägagångssätt är fortfarande föremål för upplösningen gränser konfokalmikroskop. Nyligen genomförda studier har kombinerat BiFC med FRET att möjliggöra granskning av trimolecular komplex av transkriptionsfaktorer 16. För denna tillämpning är en GFP taggad protein som används som givare och BiFC komplexet används som acceptor (dvs YFP, Venus). Detta tillvägagångssätt gör det möjligt att tidsmässigt övervakning av ett proteinkomplex och en tredjedel samverkande protein av intresse. Dessa kombinationer av tekniker möjliggör stor mångsidighet i tillämpningen av BiFC teknik för att bestämma protein: protein interaktioner. Definiera lokalisering av protein komplex i cellen är viktigt att tolka fysiologiska processer. Således representerar BiFC ett utmärkt verktyg i att bistå denna förståelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Den ITSN, PI3K-C2β, och vektorer kontrollinstrument som används i detta protokoll är tillgängliga från författarna på begäran, för icke-kommersiella syften. Författarna vill tacka Dr Chang-Deng Hu för snällt att ge råd och reagenser som används i upprättandet av BiFC protokollet i O'Bryan laboratoriet. KAW stöddes av medel från stiftelsen Jerome Lejeune. Arbetet i O'Bryan laboratoriet stöds av anslag från NIH (HL090651), DOD (PR080428), S: t Baldrick Stiftelse och Stiftelsen Jerome Lejeune.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro | 10-013 | |
| Fetal bovine serum | Cellgro | 35-011-CV | |
| Glass Bottom Microwell dishes | Matek | P35G-1.5-14C | |
| 6-well dishes | Falcon BD | 35-3846 | |
| Lipofectamine | Invitrogen | 18324020 | |
| PBS | Cellgro | 21-031-CV | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Confocal Microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM510 META |
References
- Kerppola, T. K. Visualization of molecular interactions by fluorescence complementation. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 449-456 (2006).
- Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions. Biotechniques. 40, 61-66 (2006).
- Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation. Mol Cell. 9, 789-798 (2002).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Michnick, S. W., Remy, I., Campbell-Valois, F. X., Vallee-Belisle, A., Pelletier, J. N. Detection of protein-protein interactions by protein fragment complementation strategies. Methods Enzymol. S328, 208-230 (2000).
- Michnick, S. W., MacDonald, M. L., Westwick, J. K. Chemical genetic strategies to delineate MAP kinase signaling pathways using protein-fragment complementation assays (PCA). Methods. 40, 287-293 (2006).
- Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32, 407-414 (2007).
- Ciruela, F. Fluorescence-based methods in the study of protein-protein interactions in living cells. Curr Opin Biotechnol. 19, 338-343 (2008).
- Hu, C. D., Kerppola, T. K. Simultaneous visualization of multiple protein interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nat Biotechnol. 21, 539-545 (2003).
- Martin, N. P. Intersectin regulates epidermal growth factor receptor endocytosis, ubiquitylation, and signaling. Mol Pharmacol. 70, 1643-1653 (2006).
- Das, M. Regulation of neuron survival through an intersectin-phosphoinositide 3'-kinase C2beta-AKT pathway. Mol Cell Biol. 27, 7906-7917 (2007).
- Mohney, R. P. Intersectin activates Ras but stimulates transcription through an independent pathway involving. JNK. J Biol Chem. 278, 47038-47045 (2003).
- Tong, X. K., Hussain, N. K., Adams, A. G., O'Bryan, J. P., McPherson, P. S. Intersectin can regulate the Ras/MAP kinase pathway independent of its role in endocytosis. J Biol Chem. 275, 29894-29899 (2000).
- Adams, A., Thorn, J. M., Yamabhai, M., Kay, B. K., O'Bryan, J. P. Intersectin an adaptor protein involved in clathrin-mediated endocytosis, activates mitogenic signaling pathways. J Biol Chem. 275, 27414-27420 (2000).
- O'Bryan, J. P., Mohney, R. P., Oldham, C. E. Mitogenesis and endocytosis: What's at the INTERSECTIoN? Oncogene. 20, 6300-6308 (2001).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of AP-1 NF-kappaB ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 151-156 (2008).
