הקמה התפשטות של גידולים רטינובלסטומה האדם עכברים החיסון לקויה

Summary

השיטה מתוארת להפיץ גידולים אנושיים בעכברים רטינובלסטומה. תאים סרטניים הם מוזרק ישירות לתוך עיניו של עכברים חסר החיסונית. גידולים משניים הוקמו בהצלחה הן באמצעות תאים שנקטפו ישירות גידולים אנושיים tumorspheres תרבותי.

Abstract

רטינובלסטומה culturing גידול תאים בתקשורת תא מוגדר גזע מעורר tumorspheres העיקרי ניתן לגדל ומתוחזק לזמן מוגבל בלבד. אלה tumorspheres תרבותי עשוי להפגין פנוטיפים הסלולר שונה במידה ניכרת בהשוואה הגידולים המקוריים. הפגנה כי תאים בתרבית יש את היכולת להרכיב גידולים חדשים חשוב לוודא כי הדגם תאים בתרבית הביולוגיה של הגידול המקורי.

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור הפצת גידולים רטינובלסטומה אדם in vivo באמצעות Rag2 ^{- / -} עכברים חסר החיסונית. Cultured tumorspheres רטינובלסטומה האדם של מעבר נמוך או התאים המתקבלים שנקטפו זה עתה גידולים רטינובלסטומה האדם מוזרק ישירות לתוך חלל הזגוגית של העיניים Murine טופס גידולים בתוך 2-4 שבועות. גידולים אלה ניתן לקצור ואו passaged נוספת לתוך העיניים Murine in vivo או מבוגר כמו tumorspheres במבחנה. רביה בוצעה בהצלחה על לפחות שלושה מעברים ובכך לבסס מקור מתמשך של רקמת רטינובלסטומה אדם לניסויים נוספים.

ווסלי ס בונד לאליטה Wadhwa הם שיתוף ואחת מחברי.

Protocol

1. הכנת tumorspheres רטינובלסטומה

1. השג הגידול מדגם רטינובלסטומה תחת פרוטוקול שאושר-IRB.
2. הכן טרי מוגדר תא גזע התקשורת (Neurobasal-מדיה, 1X B-27 תוסף ויטמין A מינוס, 1X שאינם חיוניים פתרון חומצת אמינו, 1X L-גלוטמין, 20 ng / mL EGF, 10 ng / mL bFGF).
3. מבחינה מכנית disaggregate רקמת הגידול עם אזמל בטכניקה צולבות חיתוך, סטרילי רקמה תרבות שטופלו 6-גם צלחת. מיד להוסיף 100 μL של התקשורת תא מוגדר גזע לרקמה בעדינות להפיץ את רקמת טחון באמצעות אזמל. הוסף 5 מ"ל של התקשורת תא גזע מוגדרים היטב.
4. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ בתוך חממה humidified ולבדוק מדי יום. Tumorspheres כמה צריך לנבוע רקמת הגידול שיבשו כמעט מיד, עם מספר גדל והולך במשך 2-4 ימים.
5. שבועי, tumorspheres צנטריפוגות ב 300xg במשך 5 דקות, resuspend ב המוכן טרי מדיה תא מוגדר גזע, pipet למעלה ולמטה 10 פעמים לשבש גדול, תחומי נמקי מרכזי ולאפשר חדשים, תחומים בריא הטופס.

2. הכנת תאים סרטניים להזרקה

1. אם הזרקת tumorspheres תרבותי, תחומי pipet בעדינות לתוך צינורית 15 מ"ל קונית. Pipet בעדינות מעלה ומטה עם pipet סרולוגיות 10-15 פעמים לשבש את התחומים.
2. ספירת התאים להיות מוזרק באמצעות hemacytometer ו aliquot לפחות 50,000 תאים לכל הזרקה לתוך צינור חדש. היכונו כמו זריקות רבות ככל האפשר על פי מספר התאים הזמינים.
3. צנטריפוגה ב 300xg במשך 5 דקות. בזהירות לשאוב supernatant ו resuspend ב 5 מ"ל PBS. חזור צנטריפוגה והשאיפה ו resuspend ב 10 PBS μL לכל זריקה.

3. הכנת בעלי חיים

1. באמצעות מזרק אינסולין, לנהל זריקה intraperitoneal של קוקטייל הרדמה מכרסם (קטמין 37.6 מ"ג / מ"ל, xylazine 1.92 מ"ג / מ"ל, acepromazine 0.38 מ"ג / מ"ל) בשעה μL 1 גרם לכל משקל גוף (gbw). המתן 5 דקות החיה להיות מסומם. בדוק דופק והמקום בעלי חיים על משטח לוהט. שמור על בעלי חיים על משטח לוהט בכל עת עד להחלמה.
2. לאחר הרגעה, לנהל ירידה של 1 proparacaine HCl בעין ימין. החלף חיה על כרית מחוממת לחכות 1 דקה.
3. ניהול 1 טיפה של phenylephrine HCl בעין ימין. החלף את חיה על כרית מחוממת לחכות 5 דקות. אם התרחבות של התלמיד לא קרה, מחדש לנהל 1 טיפה לחכות עוד 5 דקות.
4. מעקב אחר סימני חיים של תנועה, או מתעוות, אשר עשוי להתרחש בכל> 30 הדקות שלאחר הרגעה. בשלב הסימנים הראשונים של התנועה, לנהל μL 1 / gbw של קטמין הידרוכלוריד (מדולל ל -10 מ"ג / מ"ל ​​PBS) ומחכים 5 דקות.

4. הזרקה של תאים סרטניים

1. מניחים את החיה הרדים מתחת למיקרוסקופ על צידו, עם עין ימין פונה כלפי מעלה ועם הראש נח על גזה מרוכז כדי להשיג רפלקס אדום בעין ימין הפונדוס (תלמיד צריך להיות מורחבים בשלב זה) כאשר נצפו מבעד למיקרוסקופ .
2. הנכס את העולם ימינה ידי בעדינות לדחוף למטה בו זמנית עם שתי אצבעות על העפעפיים ולהחזיק בעמדה זו בהתמדה עד סוף ההליך.
3. באמצעות מחט סטרילית 30-מד מצורף מזרק Luer-מנעול, לחדור את העולם רוחבית דרך לחמית והלחמית סמוך גובלת באזור הקרנית של פלאנה Pars (איור 1), ורק דרך דמית העין לתוך חלל הזגוגית. הסר את המחט מן הפתיחה.
4. לחטא את מחט המילטון עם ספוגית אלכוהול. צייר את ההשעיה התא לתוך המזרק המילטון להכניס את המחט לתוך הפתח עד המחט היא דמיינו מבעד למיקרוסקופ מאחורי העדשה בתוך הזגוגית ליד הרשתית. בעזרת אדם נוסף, כשהוא אוחז את המחט בהתמדה במצב זה, לוחץ על המתג לאט. הסר את המחט. במידת הצורך, להשתמש צמר גפן על מנת לספוג את הנוזלים מן הפתיחה.
5. בעדינות לשחרר את הלחץ של העפעפיים כדי לסגור את העפעפיים העכבר.
6. ניהול 1 טיפה של hypromellose לכל עין ולחזור חיה לרפד מחומם להתאוששות.

5. ניטור של עכברים שהוזרק והקציר של גידולים

1. היום, לבחון את העין מוזרק עבור leukocoria (לבן papillary רפלקס) ו / או התנפחות periocular כי בדרך כלל מתברר 2-4 שבועות לאחר ההזרקה.
2. לאחר הגידול מזוהה, להרדים בעלי חיים בהתאם להנחיות מוסדיים.
3. אם את העין ואת הגידול מכוסים על ידי העפעפיים, השתמש באזמל לעשות שני חתכים אורתוגונליים אל הסדק palpebral ולהרים את שולי העור.
4. תחת להדמיה באמצעות מיקרוסקופ סטריאוסקופי, לעשות חתך ההיקפי בבית לימבוס, להסיר את הקרנית ואת העדשה, בזהירות לנתח את עיקר מסת הגידול מן ברקמות אחרות באמצעות תינניותzers. מניחים את הגידול סטרילי RPMI-1640 התקשורת.
5. השתמש פינצטה לאט למשוך את העולם לפתוח מהשקע. כדי להבטיח את עצב הראייה המצורפת כך הפלישה הגידול ניתן דמיינו, למשוך את הגלובוס עד עצב חשוף ולהשתמש מספריים לחתוך את העצבים כמה שיותר זמן. מקום 10% פורמלין לעיבוד קבוע לבדיקה היסטולוגית.

6. נציג תוצאות:

Tumorspheres רטינובלסטומה יתחילו להופיע מן הרקמה disaggregated כמעט מיד כאשר הם משוחררים מסת הגידול. בתוך 2-4 ימים, tumorspheres יותר יתחילו הטופס יגדל בגודל. הכדורים נוטים להיות קבועים התערוכה מוגדרים היטב, קרום משנית המקיפה את המצרף (איור 2).

בעלי חיים בדרך כלל מתנות עם leukocoria בתוך 4 שבועות לאחר ההזרקה (איור 3 ב), ואחריו הגדלה של הגלובוס התנפחות של הרקמות הסובבות 5-8 שבועות לאחר ההזרקה כמו הגידול גדל (איור 3c).

באיור 1. חתך תרשים של העין העכבר הדגשת תכונות הפניה בפרוטוקול.

איור 2. התרבות של תאים רטינובלסטומה אדם במבחנה צילמו בבית) 4x, ו ב) הגדלה 10x אובייקטיבי. העיקרי רטינובלסטומה תאים סרטניים לייצר tumorspheres עם צורה spheroid רגיל הקרום החיצוני פריך. ברים סולם מייצגים) 500 מיקרומטר, ב) 200 מיקרומטר.

איור 3 עין Rag2 -. / - עכבר מראה) תכונות רגיל, ב) leukocoria מעיד על מסת גידול חלל הזגוגית, ג) מסה הגידול גדול ממלא את העולם עם distension periocular קשור, דימום תוך עיני.

Discussion

הטכניקה המתוארת במסמך זה מאפשר רטינובלסטומה התפשטות גידולים בסביבה התוך עיני, intravitreal שלהם. טכניקת ההזרקה התוך עיני שימש בעבר ליצירת גידולים של רטינובלסטומה הנגזרות שורות תאים ¹ וכן לספק וקטורים ויראליים עבור ריפוי גנטי התוך עיני ^2,3. טכניקה זו עכשיו נוצלו בהצלחה לייצר גידולי רטינובלסטומה אדם על ידי הזרקה ישירה של תאים מהגידול הראשוני של הזריקה tumorspheres כמו גם התפשטות של גידולים xenograft סדרתי. ראיות גלוי של היווצרות הגידול (בדרך כלל leukocoria) הוא בדרך כלל ציין הראשון בתוך 4 שבועות, לאחר דימום תוך עיני התנפחות של ו הגלובוס / או הרקמות הסובבות את המסלול לפתח בתוך 5-8 שבועות. מיעוט של עכברים שהוזרק לפגוע עין מוזרק, המוביל סגירתו של העפעפיים. במקרים אלה, התנפחות הוא הסימן היחיד של היווצרות הגידול.

הקמת גידולים xenograft Murine לא הצליחה עם כל גידולי רטינובלסטומה האדם, אם כי התפשטות של גידולים xenograft הוקמה הוא מוצלח ביותר. תצפית זו מרמזת כי מאפיינים מסוימים של הגידול הראשוני, כגון הפולשנות ורמת בידול או כל גורם ידוע אחר, עשוי להיות השפעה על היכולת של גידולים אלה להתמיד בסביבה עינית Murine.

כמות רקמת כי ניתן לרכוש מן הגידול רטינובלסטומה האדם הוא די קטן, ויש מגבלות משמעותיות על היכולת האנושית התרבות תאים במבחנה רטינובלסטומה כגון תוחלת חיים מוגבלת, אובדן היסטולוגיה גידולים מוצקים ושינויים פנוטיפ הסלולר. פרוטוקול זה מספק דרך פשוטה יחסית, כדי להפיץ את הגידול האנושי לבסס מודל Murine של המחלה האנושית. זה מאפשר עוד במבחנה ניסויים vivo של הביולוגיה של רטינובלסטומה והתחזוקה ארוך יותר מחוץ הגידול של המטופל.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phenylephrine HCl 2.5%	Bausch and Lomb	053-11	Ophthalmic solution
30-ga Needle	BD Biosciences	305128	Regular bevel
10-mL Luer-Lock Syringe	BD Biosciences	309604
3/10-cc Insulin Syringe	BD Biosciences	328431
Alcohol swabs	BD Biosciences	326895
6-Well Plate, Tissue Culture-Treated	BD Biosciences	353046
Proparacaine HCl 0.5%	Butler Animal Health Supply	017239	Ophthalmic solution
Ketamine HCl 100mg/mL	Fort Dodge Animal Health	4402A
10-μL Hamilton Syringe	Hamilton Co	7648-01
32-ga Hamilton Needle	Hamilton Co	7803-04	Custom length - 0.5"
Neurobasal-A Media	Invitrogen	10888-022
B-27 Supplement Minus Vitamin A, 50X	Invitrogen	12587-010
RPMI-1640 Media	Mediatech, Inc.	10-040-CV
Non-essential Amino Acid Solution, 100X	Mediatech, Inc.	25-025-CI
L-Glutamine, 100X	Mediatech, Inc.	25-005-CI
Disposable #11 Scalpel	Miltex Inc.	4-411
Rodent Anesthesia Combo	N/A	n/a	In-house pharmacy formulation (ketamine 37.6 mg/mL, xylazine 1.92 mg/mL, acepromazine 0.38 mg/mL)
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)	Stem Cell Technologies	02633	Reconstitute at 10 μg/mL stock solution
Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	Stem Cell Technologies	02634	Reconstitute at 10 μg/mL stock solution
OMS-75 Operation Microscope	Topcon Medical Systems	OMS-75	This model has been discontinued
10% Formalin	VWR international	95042-908