Summary
एक विधि से चूहों में मानव retinoblastoma ट्यूमर प्रचार में वर्णित है. ट्यूमर कोशिकाओं को सीधे प्रतिरक्षा कमी चूहों की आंखों में इंजेक्ट कर रहे हैं. माध्यमिक ट्यूमर को सफलतापूर्वक किया गया है दोनों सीधे मानव ट्यूमर और सुसंस्कृत tumorspheres से काटा कोशिकाओं का उपयोग कर स्थापित है.
Abstract
परिभाषित स्टेम सेल मीडिया में संवर्धन retinoblastoma ट्यूमर कोशिकाओं कि उगाया जा सकता है केवल एक सीमित समय के लिए बनाए रखा प्राथमिक tumorspheres को जन्म देता है. ये सुसंस्कृत tumorspheres स्पष्ट रूप से अलग सेलुलर phenotypes एक्ज़िबिट जब मूल ट्यूमर की तुलना में हो सकता है. प्रदर्शन है कि सभ्य कोशिकाओं नए ट्यूमर बनाने की क्षमता है महत्वपूर्ण है कि सभ्य कोशिकाओं मॉडल मूल ट्यूमर के जीव विज्ञान सुनिश्चित करने.
/ - - प्रतिरक्षा कमी चूहों हम यहाँ मौजूद Rag2 का उपयोग vivo में मानव retinoblastoma ट्यूमर के प्रचार के लिए एक प्रोटोकॉल . संवर्धित मानव retinoblastoma tumorspheres कम बीतने या हौसले से काटा मानव retinoblastoma murine आँखों के शीशे गुहा में सीधे इंजेक्शन ट्यूमर से प्राप्त कोशिकाओं के 2-4 सप्ताह के भीतर ट्यूमर के रूप में. इन ट्यूमर और काटा जा सकता है या तो आगे vivo में murine आँखों में passaged या इन विट्रो में tumorspheres के रूप में हो. प्रचार सफलतापूर्वक किया गया है कम से कम तीन अंश इस प्रकार आगे के प्रयोग के लिए एक मानव retinoblastoma ऊतक के सतत स्रोत की स्थापना के लिए बाहर ले.
वेस्ले एस बॉण्ड और ललिता वाधवा सह पहले लेखक हैं.
Protocol
1. Retinoblastoma tumorspheres तैयार
- एक आईआरबी अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत retinoblastoma ट्यूमर नमूना प्राप्त करते हैं.
- ताजा परिभाषित स्टेम सेल मीडिया की तैयारी (Neurobasal - एक मीडिया, 1X बी 27 पूरक ऋण विटामिन ए, 1X गैर आवश्यक अमीनो एसिड समाधान, glutamine-1X एल, 20 एनजी / एमएल EGF, 10 एनजी / एमएल bFGF).
- यंत्रवत् पार काटने तकनीक का उपयोग कर एक बाँझ ऊतक में एक स्केलपेल संस्कृति इलाज 6 अच्छी तरह से थाली के साथ ट्यूमर ऊतक disaggregate. तुरंत ऊतकों को परिभाषित स्टेम सेल मीडिया के 100 μL जोड़ने और धीरे कीमा बनाया हुआ स्केलपेल का उपयोग ऊतक फैला. अच्छी तरह से परिभाषित स्टेम सेल मीडिया के 5 एमएल जोड़ें.
- 37 पर सेते डिग्री सेल्सियस, एक humidified इनक्यूबेटर में 5% सीओ 2 और दैनिक निरीक्षण. कुछ tumorspheres बाधित ट्यूमर ऊतक से लगभग तुरंत चाहिए उठता है, 2-4 दिनों के पाठ्यक्रम पर बढ़ती संख्या के साथ.
- साप्ताहिक, हौसले से तैयार परिभाषित स्टेम सेल मीडिया में 300xg पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र tumorspheres resuspend, और pipet और नीचे 10 गुना बड़े, केंद्रीय परिगलित क्षेत्रों को बाधित करने के लिए और नए, स्वस्थ क्षेत्रों के रूप में करने की अनुमति.
2. ट्यूमर कोशिकाओं के इंजेक्शन के लिए तैयार
- यदि 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में सभ्य tumorspheres, धीरे pipet क्षेत्रों इंजेक्शन. धीरे एक सीरम वैज्ञानिक pipet 10-15 बार क्षेत्रों बाधित के साथ और pipet नीचे.
- कोशिकाओं की गणना के लिए एक नया ट्यूब में एक hemacytometer, और विभाज्य इंजेक्शन प्रति कम से कम 50,000 कक्षों का उपयोग इंजेक्शन जा. संभव के रूप में उपलब्ध कक्षों की संख्या के आधार पर के रूप में कई इंजेक्शन के लिए तैयार है.
- 5 मिनट के लिए 300xg पर अपकेंद्रित्र. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला और 5 एमएल पीबीएस में resuspend aspirate. Centrifugation और आकांक्षा को दोहराएँ, और इंजेक्शन प्रति 10 μL पीबीएस में resuspend.
3. पशुओं की तैयारी
- एक इंसुलिन सिरिंज का प्रयोग, कृंतक संज्ञाहरण कॉकटेल के एक intraperitoneal इंजेक्शन (ketamine 37.6 मिलीग्राम / एमएल, xylazine 1.92 मिलीग्राम / एमएल, acepromazine 0.38 मिलीग्राम / एमएल) ग्राम शरीर के वजन के प्रति 1 μL (GBW). प्रशासन पशुओं के लिए 5 मिनट रुको करने के लिए बेहोश हो. दिल की धड़कन के लिए जाँच करें और एक गर्म पैड पर जानवरों की जगह. वसूली जब तक सभी समय पर एक गर्म पैड पर पशुओं को बनाए रखें.
- बेहोश करने की क्रिया के बाद, proparacaine एचसीएल के सही नज़र एक ड्रॉप प्रशासन. गर्म पैड पर पशु बदलें और एक मिनट रुको.
- सही नज़र एचसीएल phenylephrine की एक बूंद प्रशासन. बदलें गर्म पैड पर जानवर और 5 मिनट के इंतजार. यदि शिष्य के फैलाव नहीं हुआ है, तो फिर से 1 बूंद प्रशासन और एक और 5 मिनट तक प्रतीक्षा करें.
- आंदोलन या हिल के संकेत है, जो> 30 के बाद बेहोश करने की क्रिया मिनट पर हो सकता है के लिए पशुओं को मॉनिटर. आंदोलन का पहला संकेत पर, एक μL / ketamine एचसीएल के GBW (10 मिग्रा / पीबीएस में एमएल पतला) प्रशासन और 5 मिनट के इंतजार.
4. ट्यूमर कोशिकाओं के इंजेक्शन
- सही आंख का सामना करना पड़ के साथ अपने पक्ष पर माइक्रोस्कोप के अंतर्गत और सिर धुंध पर आराम और दाहिनी आंख बुध्न (छात्र इस समय में फैली हुई होना चाहिए) के एक लाल पलटा प्राप्त केन्द्रित जब खुर्दबीन के माध्यम से मनाया साथ anesthetized जानवर प्लेस .
- धीरे से नीचे एक साथ पलकें पर दो उंगलियों के साथ और इस स्थिति को धक्का प्रक्रिया के शेष के लिए तेजी से पकड़ कर सही दुनिया प्रोप.
- एक बाँझ 30 गेज सुई Luer ताला सिरिंज से जुड़ी का उपयोग, पियर्स laterally कंजाक्तिवा और श्वेतपटल कॉर्निया किनारी के निकट pars प्लाना के क्षेत्र में (चित्रा 1) के माध्यम से और सिर्फ कांच गुहा में रंजित के माध्यम से दुनिया भर में. उद्घाटन से सुई निकालें.
- एक शराब झाड़ू के साथ हैमिल्टन सुई जीवाणुरहित. हैमिल्टन सिरिंज में सेल निलंबन ड्रा और खोलने में सुई डालने तक सुई रेटिना के पास शीशे में लेंस के पीछे माइक्रोस्कोप के माध्यम से कल्पना है. जबकि इस स्थिति में सुई तेजी से जोत एक दूसरे व्यक्ति की मदद के साथ, सवार धीरे दबाना. सुई निकालें. यदि आवश्यक हो, एक कपास झाड़ू का उपयोग करने के लिए खोलने से कोई भी तरल पदार्थ को अवशोषित.
- धीरे माउस पलकें बंद पलकों से दबाव जारी है.
- प्रत्येक आँख को hypromellose की एक बूंद प्रशासन और वसूली के लिए गर्म पैड करने के लिए पशु वापसी.
5. चूहों अंतःक्षिप्त और ट्यूमर की कटाई की निगरानी
- दैनिक, इंजेक्शन leukocoria के लिए आंख (सफेद इल्लों से भरा हुआ पलटा) और / या periocular बढ़ाना है कि आम तौर पर स्पष्ट 2-4 सप्ताह के बाद इंजेक्शन हो जाता है की जांच.
- एक बार ट्यूमर के विकास का पता चला संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार euthanize है जानवर.
- यदि आंख और ट्यूमर पलकें द्वारा कवर कर रहे हैं, स्केलपेल का उपयोग करने के लिए दो नेत्रच्छद विदर के लिए orthogonal चीरों बनाने के लिए और त्वचा flaps को लिफ्ट.
- त्रिविम दृश्य का उपयोग कर खुर्दबीन के तहत, किनारी पर एक परिधीय चीरा बनाने, कॉर्निया और लेंस को हटाने, और ध्यान से अन्य ऊतकों का उपयोग twee से ट्यूमर जन के थोक काटनाzers. बाँझ RPMI 1640 मीडिया में ट्यूमर रखें.
- धीरे गर्तिका से खुला दुनिया खींच चिमटी का प्रयोग करें. एक संलग्न ऑप्टिक तंत्रिका सुनिश्चित करें ताकि ट्यूमर आक्रमण visualized किया जा सकता, विश्व पुल तक तंत्रिका संपर्क में है और कैंची का उपयोग करने के लिए तंत्रिका लंबे समय के रूप में संभव के रूप में में कटौती. 10% histological परीक्षा के लिए नियमित रूप से प्रसंस्करण के लिए formalin में रखें.
6. प्रतिनिधि परिणाम:
Retinoblastoma tumorspheres disaggregated ऊतकों से लगभग तुरंत के रूप में वे ट्यूमर जन से मुक्त कर रहे हैं प्रकट करने के लिए शुरू हो जाएगा. 2-4 दिनों के भीतर, और अधिक tumorspheres के लिए फार्म और आकार में वृद्धि होगी शुरू हो जाएगा. क्षेत्रों के लिए नियमित रूप से हो सकता है और एक अच्छी तरह से परिभाषित, माध्यमिक कुल (चित्रा 2) के आसपास झिल्ली प्रदर्शन करते हैं.
जानवर आमतौर पर 4 हफ्तों के भीतर पोस्ट इंजेक्शन (3b चित्रा) leukocoria साथ प्रस्तुत करता है, उसके बाद दुनिया की वृद्धि और इंजेक्शन के बाद 5-8 सप्ताह आसपास के ऊतकों की फैलावट के रूप में ट्यूमर बढ़ता (चित्रा -3 सी).
चित्रा 1 माउस प्रोटोकॉल में संदर्भित सुविधाओं पर प्रकाश डाला आँख के क्रॉस अनुभागीय आरेख.
चित्रा 2 इन विट्रो में मानव retinoblastoma कोशिकाओं की संस्कृति) 4x पर imaged है, और ख) 10x उद्देश्य बढ़ाई . Retinoblastoma प्राथमिक ट्यूमर कोशिकाओं एक नियमित उपगोल आकार और एक कुरकुरा बाहरी झिल्ली के साथ tumorspheres उत्पादन. स्केल सलाखों एक) 500 सुक्ष्ममापी का प्रतिनिधित्व करते हैं, और ख) 200 सुक्ष्ममापी.
चित्रा 3 Rag2 के नेत्र - / - एक) सामान्य सुविधाओं दिखा, ख माउस) शीशे गुहा में एक ट्यूमर जन का संकेत leukocoria, और ग) एक बड़े ट्यूमर जन जुड़े periocular बढ़ाव, intraocular नकसीर के साथ दुनिया भर में भरने.
Discussion
इस के साथ साथ वर्णित तकनीक अपने intraocular, intravitreal परिवेश में प्रचार retinoblastoma ट्यूमर की सुविधा है. intraocular इंजेक्शन तकनीक अतीत में इस्तेमाल किया गया है retinoblastoma व्युत्पन्न सेल लाइनों के रूप में 1 के रूप में अच्छी तरह से intraocular जीन चिकित्सा 2,3 के लिए वायरल vectors देने से ट्यूमर बनाने . अब इस तकनीक को सफलतापूर्वक किया गया है के प्राथमिक ट्यूमर और tumorspheres के इंजेक्शन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से xenograft ट्यूमर के धारावाहिक प्रचार से कोशिकाओं के प्रत्यक्ष इंजेक्शन द्वारा मानव retinoblastoma ट्यूमर का उत्पादन का उपयोग. ट्यूमर गठन (आमतौर पर leukocoria) के दर्शनीय सबूत आम तौर पर पहले 4 हफ्तों के भीतर नोट किया, जिसके बाद intraocular नकसीर और दुनिया और / या ऊतकों की फैलावट कक्षा आसपास 5-8 सप्ताह के भीतर विकसित. इंजेक्शन चूहों के एक अल्पसंख्यक के इंजेक्शन आँख घायल, पलकों के स्थायी बंद करने के लिए अग्रणी. इन मामलों में, फैलावट ट्यूमर गठन का ही संकेत है.
Murine xenograft ट्यूमर की स्थापना मानव के सभी retinoblastoma ट्यूमर के साथ सफल नहीं किया गया है, हालांकि स्थापित xenograft ट्यूमर के प्रसार अत्यधिक सफल रहा है. इस अवलोकन से पता चलता है कि प्राथमिक ट्यूमर के invasiveness और भेदभाव या कुछ अन्य अज्ञात कारक के स्तर जैसे कुछ विशेषताओं, murine नेत्र वातावरण में जारी रहती है इन ट्यूमर की क्षमता को प्रभावित किया जा सकता है.
ऊतक की राशि है कि एक मानव retinoblastoma ट्यूमर से प्राप्त किया जा सकता है काफी छोटा है, और संस्कृति सीमित जीवन काल, ठोस ट्यूमर के ऊतक विज्ञान के नुकसान और सेलुलर phenotype में परिवर्तन के रूप में इन विट्रो में मानव retinoblastoma कोशिकाओं की क्षमता पर महत्वपूर्ण सीमाएं हैं. इस प्रोटोकॉल मानव ट्यूमर का प्रचार करने के लिए और मानव रोग के एक murine मॉडल की स्थापना के लिए एक अपेक्षाकृत सरल तरीका प्रदान करता है. यह इन विट्रो में और vivo प्रयोग में retinoblastoma और रोगी की ट्यूमर बाहर की अब रखरखाव के जीव विज्ञान के आगे की अनुमति देता है.
Disclosures
जानवरों पर प्रयोग Baylor कॉलेज ऑफ मेडिसिन IACUC समिति के द्वारा निर्धारित दिशा निर्देशों और नियमों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया.
Acknowledgments
इस परियोजना के लिए अनुदान अनुसंधान और रेटिना रिसर्च फाउंडेशन के लिए क्लेटन फाउंडेशन द्वारा प्रदान की गई है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phenylephrine HCl 2.5% | Bausch and Lomb | 053-11 | Ophthalmic solution |
| 30-ga Needle | BD Biosciences | 305128 | Regular bevel |
| 10-mL Luer-Lock Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| 3/10-cc Insulin Syringe | BD Biosciences | 328431 | |
| Alcohol swabs | BD Biosciences | 326895 | |
| 6-Well Plate, Tissue Culture-Treated | BD Biosciences | 353046 | |
| Proparacaine HCl 0.5% | Butler Animal Health Supply | 017239 | Ophthalmic solution |
| Ketamine HCl 100mg/mL | Fort Dodge Animal Health | 4402A | |
| 10-μL Hamilton Syringe | Hamilton Co | 7648-01 | |
| 32-ga Hamilton Needle | Hamilton Co | 7803-04 | Custom length - 0.5" |
| Neurobasal-A Media | Invitrogen | 10888-022 | |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A, 50X | Invitrogen | 12587-010 | |
| RPMI-1640 Media | Mediatech, Inc. | 10-040-CV | |
| Non-essential Amino Acid Solution, 100X | Mediatech, Inc. | 25-025-CI | |
| L-Glutamine, 100X | Mediatech, Inc. | 25-005-CI | |
| Disposable #11 Scalpel | Miltex Inc. | 4-411 | |
| Rodent Anesthesia Combo | N/A | n/a | In-house pharmacy formulation (ketamine 37.6 mg/mL, xylazine 1.92 mg/mL, acepromazine 0.38 mg/mL) |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Stem Cell Technologies | 02633 | Reconstitute at 10 μg/mL stock solution |
| Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Stem Cell Technologies | 02634 | Reconstitute at 10 μg/mL stock solution |
| OMS-75 Operation Microscope | Topcon Medical Systems | OMS-75 | This model has been discontinued |
| 10% Formalin | VWR international | 95042-908 |
References
- Chèvez-Barrios, P. Metastatic and Nonmetastatic Models of Retinoblastoma. Am. J. Pathol. 157, 1405-1412 (2000).
- Suber, M. L., Hurwitz, M. Y., Chèvez-Barrios, P., Hurwitz, R. L. Immune consequences of intraocular administration of modified adenoviral vectors. Hum. Gene Ther. 12, 833-838 (2001).
- Mallam, J. N., Hurwitz, M. Y., Mahoney, T., Chèvez-Barrios, P., Hurwitz, R. L. Efficient Gene Transfer into Retinal Cells Using Adenoviral Vectors: Dependence on Receptor Expression. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45, 1680-1687 (2004).
