Summary
방법은 생쥐에서 인간의 retinoblastoma 종양을 전파하기 위해 설명되어 있습니다. 종양 세포에 직접 면역 결함 생쥐의 눈을에 주입하고 있습니다. 이차 종양이 성공적으로 직접적으로 인간의 종양과 교양 tumorspheres에서 수확을 모두 세포를 사용하여 설립되었습니다.
Abstract
정의 줄기 세포 미디어에 Culturing의 retinoblastoma 종양 세포는 제한된 시간 동안 성장 유지 수있는 기본 tumorspheres에 상승을 제공합니다. 원래 종양에 비해 이러한 교양 tumorspheres은 현저하게 다른 세포 phenotypes 발생할 수 있습니다. 교양 세포가 새로운 종양을 형성의 기능을 가지고 데모는 교양 세포 모델에게 원래 종양의 생물학을 보장하는 것이 중요합니다.
/ - - 면역 결함 쥐들이 여기 Rag2를 사용하여 생체내 인간의 retinoblastoma의 종양 증식을위한 프로토콜을 제시한다. 낮은 통로 또는 murine 눈 유리체 캐비티에 직접 주입 갓 수확 인간 retinoblastoma의 종양에서 얻은 세포의 교양 인간 retinoblastoma의 tumorspheres는 2~4주 이내에 종양을 형성. 이러한 종양은 수확과 중 추가로 생체내에 murine 눈을 passaged이나 체외에서 tumorspheres로 성장하실 수 있습니다. 전파가 성공적으로 추가되므로 실험에 대한 인간의 retinoblastoma 조직의 지속적인 소스를 수립 최소한 세 구절에 대해 실시되었습니다.
웨슬리 S. 본드와 Lalita Wadhwa는 공동 첫번째 작가입니다.
Protocol
1. retinoblastoma의 tumorspheres의 준비
- IRB 승인 프로토콜에 따라 retinoblastoma 종양 샘플을 구합니다.
- 신선한 정의 줄기 세포 미디어를 준비 (Neurobasal - A 미디어, 1X B - 27 보충 마이너스 비타민 A, 1X 아닌 필수 아미노산 솔루션 1X L - 글루타민, 20 NG / ML EGF, 10 NG / ML bFGF).
- 기계식 멸균, 조직의 크로스 커팅 기법을 사용하여 메스 문화 처리 6 잘 플레이트와 종양 조직을 disaggregate. 즉시 조직에 정의된 줄기 세포 미디어 100 μL를 추가하고 부드럽게 메스를 사용하여 다진 조직을 확산. 잘 정의된 줄기 세포 미디어의 5 ML을 추가합니다.
- 37 품어 ° C, 5 humidified 인큐베이터에서 % CO 2 및 일일 점검. 일부 tumorspheres는 2~4일 과정 이상의 증가와 함께, 거의 즉시 중단 종양 조직에서 발생한다.
- 주간, 5 분 300xg에서 원심 분리기의 tumorspheres은 신선한 정의 줄기 세포 미디어에 resuspend하고, pipet 위아래로 10 배 이상 큰, 중앙 괴사 분야를 방해하고 새로운, 건강 분야는 양식 수 있습니다.
2. 주사에 대한 종양 세포의 준비
- 경우 15 ML 원뿔 관에 부드럽게 교양 tumorspheres, pipet의 분야를 넣고. serological pipet 분야를 혼란 10-15 시간으로 부드럽게 위아래로 pipet.
- 새로운 튜브에 hemacytometer하고, 나누어지는 주사 적어도 초당 50,000 전지를 사용하여 주입하는 세포를 계산합니다. 가능한 세포의 개수에 따라 가능한 한 많은 주사 준비.
- 5 분 300xg에서 원심 분리기. 조심스럽게 5 ML PBS에서 뜨는 및 resuspend을 대기음. 원심 분리와 열망을 반복하고, 사출 당 10 μL PBS에 resuspend.
3. 동물의 준비
- 인슐린 주사기를 사용하여, 쥐 마취 칵테일의 intraperitoneal 주사 (케타민을 37.6 MG / ML, xylazine 1.92 MG / ML, acepromazine 0.38 MG / ML) g 체중 당 1 μL (gbw)에서.를 관리 진정이 될 수있는 동물 5 분 동안 기다리십시오. 하트 비트에 대한 확인 및 온수 패드에 동물을 놓으십시오. 복구까지 항상 온수 패드에 동물을 유지합니다.
- 진정 작용 후, 오른쪽 눈에 proparacaine HCL 1 방울을 관리할 수 있습니다. 온수 패드에 동물을 교체하고 1 분 기다립니다.
- 오른쪽 눈에 HCL을 phenylephrine 1 방울을 관리할 수 있습니다. 온수 패드에있는 동물을 교체하고 5 분간 기다립니다. 학생의 지연이 발생하지 않은 경우 1, 드롭을 다시 관리하고 다른 5 분 기다립니다.
- > 삼십분 후 진정 작용에서 발생할 수있는 운동이나 꿈틀의 흔적에 대한 동물을 모니터링합니다. 운동의 초기 징조에, 1 μL / 케타민을 HCL의 gbw (10 MG / PBS에 ML에 희석) 관리하고 5 분 기다립니다.
4. 종양 세포의 주입
- 최대 직면한 오른쪽 눈과 머리는 거즈에 휴식과 현미경을 통해 관찰하면 오른쪽 눈이 fundus (학생이 동시에 확대되어야합니다)의 붉은 반사를 얻을 중심으로 자사의 측면에있는 현미경 anesthetized 동물을 플레이스 .
- 부드럽게 눈꺼풀에 두 손가락으로 동시에 아래로 밀어와 절차의 나머지를 위해 꾸준히이 위치를 고수하여 바로 세계를 프로프.
- 피어스 갈 거예요 플라나의 영역에서 각막 limbus에 인접 결막 및 공막엔 (그림 1)를 통해 단 유리 구멍에 맥락막 통해 옆으로, Luer - 잠금 주사기에 부착된 멸균 30 게이지 바늘을 세계 사용합니다. 오프닝에서 바늘을 제거합니다.
- 알코올 면봉으로 해밀턴 바늘을 소독. 해밀턴 주사기로 세포 현탁액을 내리고 바늘이 망막 근처의 유리체에서 렌즈 뒤에 현미경을 통해 시각 때까지 개방에 바늘을 삽입합니다. 이 위치에 꾸준히 바늘을 누른 상태에서 두 번째 사람의 도움으로 플런저를 천천히 우울. 바늘을 제거합니다. 필요한 경우, 개막으로부터 액체를 흡수하기 위해 면봉을 사용합니다.
- 부드럽게 마우스 눈꺼풀을 닫을 수있는 눈꺼풀의 압력을 풀어주고있다.
- 각각의 눈에 hypromellose 1 방울을 관리하고 복구를 위해 온수 패드로 동물을 반환합니다.
5. 주입 마우스 및 종양의 수확의 모니터링
- 매일, 보통 2~4주 포스트 분사 명백한된다 주입 leukocoria 눈을 (화이트 젖꼭지 반사) 및 / 또는 periocular 팽창을 확인합니다.
- 일단 종양 성장 동물 제도적 지침에 따라, 안락사 감지합니다.
- 눈 및 종양은 눈꺼풀이 적용하는 경우, palpebral 균열 (fissure)에 직교이 incisions을 만들고 피부 날개를 리프트에 메스를 사용합니다.
- 실체 현미경을 사용하여 시각화에서 각막과 렌즈를 제거 limbus에서 원주 절개를하고, 신중하게 트위를 사용하여 다른 조직에서 종양 질량의 대부분을 해부하다zers. 무균 RPMI - 1640 미디어 종양을 놓으십시오.
- 천천히 소켓에서 열린 세계를 당길 족집게를 사용합니다. 종양 침공은 시각 수 있도록 연결된 시신경을 보장하기 위해, 신경이 노출까지 세계를 당겨하고 가능한 한 오랫동안 신경을 절단하는 가위를 사용합니다. histological 시험에 대한 일반적인 처리를 위해 포르말린 10 % 놓습니다.
6. 대표 결과 :
Retinoblastoma의 tumorspheres 거의 즉시 그들은 종양 덩어리에서 해방되면서 disaggregated 조직에서 나타나기 시작합니다. 2-4일 내에 더 많은 tumorspheres는 형태와 크기로 증가하기 시작합니다. 분야는 정기적으로하고 집계합니다 (그림 2) 주변의 잘 정의된, 보조 멤브레인을 전시하는 경향이 있습니다.
동물은 일반적으로 세계와 종양이 성장함에 따라 5~8주 주입 후 주변 조직의 팽창의 확대에 의해 다음, 사주 후 사출 (그림 3B) 이내 leukocoria과 함께 선물 (그림 3C).
그림 1. 프로토콜에 언급된 기능을 강조 마우스 눈의 크로스 - 단면.
그림 2. 체외에서 인간 retinoblastoma 세포의 문화) 4X에서 몇 군데, 그리고 B) 10X 목적의 확대. Retinoblastoma 기본 종양 세포는 일반적인 회전 타원체 모양과 선명한 외부 막과 tumorspheres을 생산합니다. 스케일 바) 500 μm의를 대표하고, B) 200 μm의.
그림 3 Rag2의 눈 -. / -, B를 A) 정상적인 기능을 보여주는 마우스) 유리 곳에 종양이 대량 나타내는 leukocoria, 및 C)은 큰 종양의 질량 관련 periocular의 팽만, intraocular 출혈과 함께 지구를 작성.
Discussion
여기 설명한 기술들은 intraocular, intravitreal 환경에서 전파 retinoblastoma의 종양을 용이하게합니다. intraocular 사출 기술은 retinoblastoma 유도 세포 라인 한뿐 아니라 intraocular 유전자 치료 2,3에 대한 바이러스 벡터를 제공하는에서 종양을 만들기 위해 과거에 사용되고 있습니다. 이 기술은 현재 성공적으로 기본 종양 및 사출 tumorspheres의뿐만 아니라 이종 이식 종양의 일련 전파의 세포를 직접 주입하여 인간 retinoblastoma의 종양을 생산하기 위해 이용되었다. 종양 형성 (보통 leukocoria)의 표시 증거는 대개 먼저 궤도를 둘러싼 세계 및 / 또는 조직의 intraocular 출혈과 팽창이 5-8주 이내에 개발하는 후 4 주 이내에 기록됩니다. 주입된 생쥐의 소수 민족은 눈꺼풀의 영구 폐쇄에 이르는, 주입 눈을 다치게. 이러한 경우에는 팽창은 종양 형성의 유일한 기호이다.
설립 이종 이식 종양의 전파는 매우 성공하지만 murine 이종 이식 종양의 확립, 모든 인간의 retinoblastoma의 종양과 함께 성공되지 않았습니다. 이 관찰은 invasiveness과 차별화 또는 다른 알려지지 않은 요소의 수준으로 기본 종양의 특정 특성, murine 안구 환경에서 계속 이러한 종양의 능력에 영향을 미치는있을 것입니다.
인간 retinoblastoma 종양에서 얻은 수있는 조직의 양은 매우 작은, 그리고 제한된 수명, 고체 종양의 조직학의 손실과 세포 표현형 변화로 체외에서 문화 인간 retinoblastoma 세포 수있는 능력에 상당한 제한이있다. 이 프로토콜은 인간의 종양을 전파하고 인간의 질병의 murine 모델을 수립하는 비교적 간단한 방법을 제공합니다. 이것은 체외에서 retinoblastoma와 환자의 종양 이외의 더 이상 유지 보수의 생물학의 생체내 실험에서 추가하실 수 있습니다.
Disclosures
동물 실험은 의학 IACUC위원회의 베일러 대학에서 정한 지침과 규정에 따라 수행되었다.
Acknowledgments
이 프로젝트에 대한 자금은 연구 및 망막 연구 재단 클레이튼 재단에 의해 제공됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phenylephrine HCl 2.5% | Bausch and Lomb | 053-11 | Ophthalmic solution |
| 30-ga Needle | BD Biosciences | 305128 | Regular bevel |
| 10-mL Luer-Lock Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| 3/10-cc Insulin Syringe | BD Biosciences | 328431 | |
| Alcohol swabs | BD Biosciences | 326895 | |
| 6-Well Plate, Tissue Culture-Treated | BD Biosciences | 353046 | |
| Proparacaine HCl 0.5% | Butler Animal Health Supply | 017239 | Ophthalmic solution |
| Ketamine HCl 100mg/mL | Fort Dodge Animal Health | 4402A | |
| 10-μL Hamilton Syringe | Hamilton Co | 7648-01 | |
| 32-ga Hamilton Needle | Hamilton Co | 7803-04 | Custom length - 0.5" |
| Neurobasal-A Media | Invitrogen | 10888-022 | |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A, 50X | Invitrogen | 12587-010 | |
| RPMI-1640 Media | Mediatech, Inc. | 10-040-CV | |
| Non-essential Amino Acid Solution, 100X | Mediatech, Inc. | 25-025-CI | |
| L-Glutamine, 100X | Mediatech, Inc. | 25-005-CI | |
| Disposable #11 Scalpel | Miltex Inc. | 4-411 | |
| Rodent Anesthesia Combo | N/A | n/a | In-house pharmacy formulation (ketamine 37.6 mg/mL, xylazine 1.92 mg/mL, acepromazine 0.38 mg/mL) |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Stem Cell Technologies | 02633 | Reconstitute at 10 μg/mL stock solution |
| Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Stem Cell Technologies | 02634 | Reconstitute at 10 μg/mL stock solution |
| OMS-75 Operation Microscope | Topcon Medical Systems | OMS-75 | This model has been discontinued |
| 10% Formalin | VWR international | 95042-908 |
References
- Chèvez-Barrios, P. Metastatic and Nonmetastatic Models of Retinoblastoma. Am. J. Pathol. 157, 1405-1412 (2000).
- Suber, M. L., Hurwitz, M. Y., Chèvez-Barrios, P., Hurwitz, R. L. Immune consequences of intraocular administration of modified adenoviral vectors. Hum. Gene Ther. 12, 833-838 (2001).
- Mallam, J. N., Hurwitz, M. Y., Mahoney, T., Chèvez-Barrios, P., Hurwitz, R. L. Efficient Gene Transfer into Retinal Cells Using Adenoviral Vectors: Dependence on Receptor Expression. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45, 1680-1687 (2004).
