Estabelecimento e propagação de Tumores Humanos em Retinoblastoma Imune camundongos deficientes

Summary

Um método é descrito para propagar tumores retinoblastoma humano em camundongos. Células tumorais são diretamente injetadas nos olhos de ratos imune deficiente. Tumores secundários foram estabelecidas com sucesso usando as duas células diretamente colhidas a partir de tumores humanos e tumorspheres cultivadas.

Abstract

A cultura de células de tumor retinoblastoma nos meios de comunicação célula-tronco dá origem definida para tumorspheres primária que pode ser cultivado e mantido apenas por um período limitado. Estes tumorspheres cultivadas podem apresentar marcadamente diferentes fenótipos celulares quando comparado aos tumores original. Demonstração de que as células cultivadas têm a capacidade de formar novos tumores é importante para garantir que o modelo células cultivadas a biologia do tumor original.

Aqui apresentamos um protocolo para a propagação de tumores retinoblastoma humano in vivo utilizando RAG2 ^{- / -} ratos imunológico deficiente. Cultivadas tumorspheres retinoblastoma humano de passagem baixa ou células obtidas de recém-colhido tumores retinoblastoma humano injetado diretamente na cavidade vítrea de olhos murino formar tumores dentro de 2-4 semanas. Estes tumores podem ser colhidas e quer ainda várias passagens nos olhos murino in vivo ou crescido como tumorspheres in vitro. Propagação foi realizado com sucesso há pelo menos três passagens estabelecendo assim uma fonte contínua de tecido retinoblastoma humano para fazer novas experiências.

Wesley S. Bond e Lalita Wadhwa são co-autores primeiro.

Protocol

1. Preparação de tumorspheres retinoblastoma

1. Obtenção de amostra de tumor retinoblastoma em um IRB-aprovado protocolo.
2. Prepare fresca media de células-tronco definido (Neurobasal-A mídia, 1X B-27 suplemento menos vitamina A, 1X não essenciais solução de aminoácidos, L-glutamina 1X, 20 ng / mL EGF, 10 ng / mL bFGF).
3. Mecanicamente desagregar o tecido tumoral com um bisturi, usando uma técnica transversal em um tecido estéril, a cultura tratados com seis bem-chapa. Imediatamente adicione 100 mL de mídia células-tronco para definir o tecido e delicadamente espalhar o tecido picada usando o bisturi. Adicionar 5 mL dos meios de comunicação de células-tronco definido para o bem.
4. Incubar a 37 ° C, 5% de CO ₂ em uma incubadora umidificada e inspecionar diariamente. Alguns tumorspheres deve surgir a partir do tecido tumoral interrompido quase imediatamente, com um número crescente ao longo de 2-4 dias.
5. Semanais, tumorspheres centrifugue a 300xg por 5 minutos, ressuspender em recém-preparados media células-tronco definido, e pipeta cima e para baixo 10 vezes para interromper maior, esferas de necrose central e permitir que novas esferas saudáveis ​​a se formar.

2. Preparação de células tumorais para injecção

1. Se injetar tumorspheres cultivadas, gentilmente esferas pipeta para um tubo de 15 mL cônico. Pipeta suavemente para cima e para baixo com uma pipeta sorológica 10-15 vezes de interromper as esferas.
2. Contar as células a ser injetado através de um hemocitômetro, e alíquota, pelo menos, 50 mil células por injeção em um novo tubo. Prepare-se para muitos como injeções possível com base no número de células disponíveis.
3. Centrifugar a 300xg por 5 minutos. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender em 5 mL de PBS. Repetir a centrifugação e aspiração, e ressuspender em 10 mL PBS por injeção.

3. Preparação dos animais

1. Usando uma seringa de insulina, administrar uma injeção intraperitoneal de cocktail anestesia roedores (ketamina 37,6 mg / mL, xilazina 1,92 mg / mL, acepromazina 0,38 mg / mL) a 1 mL por grama de peso corporal (GBW). Espere 5 minutos para que o animal se sedado. Verifique se há batimento cardíaco e colocar o animal em uma almofada aquecida. Manter animais em uma almofada aquecida em todas as vezes até a recuperação.
2. Após a sedação, administrar 1 gota de HCl proximetacaína no olho direito. Substituir animais na almofada aquecida e espere um minuto.
3. Administrar 1 gota de fenilefrina HCl para o olho direito. Substituir o animal na almofada aquecida e aguarde 5 minutos. Se a dilatação da pupila não ocorreu, re-administrar 1 gota e esperar mais 5 minutos.
4. Monitorar os animais em busca de sinais de movimento ou contração muscular, que pode ocorrer em> 30 minutos após a sedação. Aos primeiros sinais de movimento, administrar 1 mL / GBW de cetamina HCl (diluído a 10 mg / mL em PBS) e aguarde 5 minutos.

4. Injeção de células tumorais

1. Coloque o animal anestesiado sob o microscópio de lado, com o olho direito para cima e com a cabeça descansando sobre uma gaze e centrado para obter um reflexo vermelho do fundo do olho direito (pupila dilatada deve ser neste momento) quando observada através do microscópio .
2. Escorar o globo direito empurrando levemente para baixo simultaneamente com dois dedos sobre as pálpebras e mantenha esta posição de forma constante para o restante do procedimento.
3. Usando uma agulha estéril de calibre 30 acoplada a uma seringa Luer-lock, furar o globo lateralmente através da conjuntiva e esclera adjacente ao limbo da córnea na área da pars plana (Figura 1) e apenas através da coróide na cavidade vítrea. Retire a agulha da abertura.
4. Esterilizar a agulha Hamilton com um algodão embebido em álcool. Chamar a suspensão de células para dentro da seringa Hamilton e inserir a agulha na abertura até que a agulha é visualizado através do microscópio atrás da lente no vítreo perto da retina. Com a ajuda de uma segunda pessoa, enquanto segura a agulha firmemente nesta posição, o êmbolo lentamente. Remova a agulha. Se necessário, use um cotonete para absorver qualquer líquido da abertura.
5. Gentilmente liberar a pressão das pálpebras para fechar as pálpebras mouse.
6. Administrar 1 gota de hipromelose para cada olho e voltar animal para almofada aquecida para recuperação.

5. Monitoramento de camundongos injetados e colheita de tumores

1. Diária, examine o olho injetado de leucocoria (reflexo branco papilar) e / ou distensão periocular que geralmente se torna aparente 2-4 semanas após a injecção.
2. Uma vez que o crescimento do tumor é detectado, a eutanásia de animais de acordo com as diretrizes institucionais.
3. Se o tumor do olho e são cobertos por pálpebras, use o bisturi para fazer duas incisões ortogonal à fenda palpebral e levante a retalhos cutâneos.
4. Sob visualização usando o microscópio estereoscópico, faça uma incisão circunferencial no limbo, eliminando a córnea ea lente, e dissecar cuidadosamente a maior parte da massa tumoral a partir de outros tecidos usando tweezers. Coloque o tumor em estéril RPMI-1640 mídia.
5. Use uma pinça para retirar o mundo aberto a partir do soquete. Para garantir um nervo ligado óptica para a invasão do tumor pode ser visualizado, puxe o mundo até que o nervo é exposto e usar a tesoura para cortar o nervo maior tempo possível. Coloque em formalina 10% para regular processamento para exame histológico.

6. Resultados representativos:

Tumorspheres retinoblastoma começarão a aparecer a partir do tecido desagregados quase imediatamente como eles são liberados a partir da massa tumoral. Dentro de 2-4 dias, mais tumorspheres começará a forma e vai aumentar de tamanho. As esferas tendem a ser regular e exibem uma membrana bem definida, secundárias em torno do agregado (Figura 2).

O animal normalmente apresenta-se com leucocoria dentro de 4 semanas pós-injeção (Figura 3b), seguido pelo alargamento do globo e distensão dos tecidos circundantes 5-8 semanas após a injeção que o tumor cresce (Figura 3c).

Figura 1. Transversal diagrama do olho do rato que destaca as características referenciadas no protocolo.

Figura 2. Cultura de células humanas in vitro retinoblastoma fotografada em um 4x), e b) ampliação da objetiva 10x. Retinoblastoma células do tumor primário produzir tumorspheres com uma forma regular esférica e uma membrana externa crisp. Barras de escala representam a) 500 mm, e b) M 200.

Figura 3 Eye of RAG2 -. / - Mostrando um rato características) normal, b) leucocoria indicativo de uma massa tumoral na cavidade vítrea, e c) uma grande massa tumoral preenchendo o mundo com distensão periocular associados, hemorragia intra-ocular.

Discussion

A técnica descrita a seguir facilita a propagação de tumores retinoblastoma no seu meio, intraocular intravítrea. A técnica de injeção intra-ocular tem sido usado no passado para criar tumores a partir de linhas de células derivadas de retinoblastoma ^1, bem como para entregar vetores virais para terapia genética intra-ocular ^2,3. Esta técnica já foi utilizada com sucesso para produzir tumores retinoblastoma humano por injeção direta de células do tumor primário e injeção de tumorspheres bem como a propagação de série de tumores xenoenxerto. Evidência visível de formação de tumores (geralmente leucocoria) é geralmente observado pela primeira vez dentro de 4 semanas, após o que a hemorragia intra-ocular e distensão do globo e / ou tecidos que circundam a órbita desenvolver dentro de 5-8 semanas. Uma minoria de camundongos injetados ferir o olho injetado, levando ao encerramento definitivo das pálpebras. Nestes casos, a distensão é o único sinal de formação de tumores.

Estabelecimento de tumores xenoenxerto murino não foi bem sucedido com todos os tumores retinoblastoma humano, embora a propagação de tumores xenoenxerto estabelecido é altamente bem sucedido. Esta observação sugere que certas características do tumor primário, como a invasão e nível de diferenciação ou algum outro fator desconhecido, pode estar influenciando a capacidade de estes tumores de persistir no ambiente ocular murino.

A quantidade de tecido que podem ser adquiridos a partir de um tumor retinoblastoma humano é muito pequeno, e há limitações significativas sobre a capacidade de células cultura humana retinoblastoma in vitro, tais como tempo de vida limitado, a perda de histologia do tumor sólido e mudanças no fenótipo celular. Este protocolo fornece uma maneira relativamente simples de propagar o tumor humano e estabelecer um modelo murino da doença humana. Isso permite que mais in vitro e em experimentação in vivo de biologia do retinoblastoma e de manutenção mais longos do lado de fora do tumor do paciente.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phenylephrine HCl 2.5%	Bausch and Lomb	053-11	Ophthalmic solution
30-ga Needle	BD Biosciences	305128	Regular bevel
10-mL Luer-Lock Syringe	BD Biosciences	309604
3/10-cc Insulin Syringe	BD Biosciences	328431
Alcohol swabs	BD Biosciences	326895
6-Well Plate, Tissue Culture-Treated	BD Biosciences	353046
Proparacaine HCl 0.5%	Butler Animal Health Supply	017239	Ophthalmic solution
Ketamine HCl 100mg/mL	Fort Dodge Animal Health	4402A
10-μL Hamilton Syringe	Hamilton Co	7648-01
32-ga Hamilton Needle	Hamilton Co	7803-04	Custom length - 0.5"
Neurobasal-A Media	Invitrogen	10888-022
B-27 Supplement Minus Vitamin A, 50X	Invitrogen	12587-010
RPMI-1640 Media	Mediatech, Inc.	10-040-CV
Non-essential Amino Acid Solution, 100X	Mediatech, Inc.	25-025-CI
L-Glutamine, 100X	Mediatech, Inc.	25-005-CI
Disposable #11 Scalpel	Miltex Inc.	4-411
Rodent Anesthesia Combo	N/A	n/a	In-house pharmacy formulation (ketamine 37.6 mg/mL, xylazine 1.92 mg/mL, acepromazine 0.38 mg/mL)
Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF)	Stem Cell Technologies	02633	Reconstitute at 10 μg/mL stock solution
Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	Stem Cell Technologies	02634	Reconstitute at 10 μg/mL stock solution
OMS-75 Operation Microscope	Topcon Medical Systems	OMS-75	This model has been discontinued
10% Formalin	VWR international	95042-908