Dissection ו 2-Photon הדמיה של בלוטות לימפה הפריפריה עכברים

Summary

שני הפוטונים הדמיה חשף תנועתיות הלימפוציטים אינטראקציות הסלולר בתוך הצומת לימפה בתנאי הבסיס, במהלך תגובה חיסונית ^1. הנה, אנחנו מדגימים העברת המאמצת של תאים T, בידוד של בלוטות הלימפה, ועל תנועתיות הדמיה של CD4 + T תאים בתוך הצומת לימפה explanted.

Abstract

שני הפוטונים הדמיה חשף כוריאוגרפיה אלגנטי של תנועתיות אינטראקציות הסלולר בתוך הצומת לימפה בתנאים הבסיסיים ועל ייזום של תגובה חיסונית ^1. כאן, אנו מציגים שיטות להעברת המאמצת של תאים T שכותרתו, בידוד של בלוטות הלימפה, ועל תנועתיות הדמיה של CD4 + T תאים בתוך הצומת לימפה explanted כפי שתוארה לראשונה בשנת 2002 ^2. הדמיה דו פוטון של תאים חיסוניים דורש כי תאים שכותרתו fluorescently, או על ידי צביעה עם צבע גשש התא או על ידי הבעת חלבון פלואורסצנטי. אנו מדגימים את הליך העברת המאמצת של תאים שמקורם הזרקת עכברים התורם לווריד הזנב של חיה הנמען, שם הם בבית הלימפה לאיברים בתוך כ 15-30 דקות. אנו מדגימים את הבידוד של לימפה ולתאר שיטות כדי להבטיח הרכבה נכונה של הצומת לימפה נכרת. שיקולים נוספים כגון חמצון תקין של התקשורת perfused, טמפרטורה, כוח לייזר הם דנו. לבסוף, אנו מציגים תמונות וידאו 3D של CD4 + T תאים נאיבי מפגין תנועתיות מצב יציב על 37 ° C.

Protocol

1. העברת המאמצת של תאים:

וריד הזנב או הזרקה תוך עיני הן שיטות מתאים כניסתה של התא גשש שכותרתו או פלורסנט חלבון להביע לימפוציטים. בסרטון זה. אנחנו מדגימים את העברת המאמצת של תאים על ידי הזרקה לווריד הזנב.

א חומרים

CD4 + T תאים מסומנים עם CFSE 1.4 מיקרומטר במשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות, שטפתי פעמיים, שוב תלוי μL 100 של RPMI-1640. תאים נטענים לתוך מזרק סטרילי מד 28 אינסולין להזרקה. מספר תאים המשמשים תלוי בניסוי שנעשה. בדרך כלל, 5,000,000 ותאי T הם מספיק להדמיה פשוטה תא T. עוצר מכרסם עבור העכבר הוא זקוק כדי למנוע פגיעה בבעלי חיים ועל לעצמך.

ב שמירה על בעלי חיים

העכבר הוא מאובטח להעברת המאמצת ידי לאט גיבוי חיה לתוך עוצר המכרסם (ראה וידאו) לסגור את הקצה הפתוח של הצינור על ידי מדכא בעדינות על הבוכנה. אל תעזוב את העכבר הזנב במהלך תהליך זה, כמו כמה חיות קטן יכול להסתובב בתוך עוצר. שיטה זו מונעת את החיה מפגיעה עצמה לנוע במהלך ההזרקה. כאשר הגדרת עוצר מכרסם, לא לדחוף את הבוכנה ב רחוק יותר יש צורך לשמור על בעלי החיים לקפוץ קדימה. כמו כן, לא לדחוף את הבוכנה כלפי בעלי חיים, ולא להשאיר את החיה עוצר לתקופה ממושכת של זמן.

ג לדמיין את וריד הזנב

משוך בעדינות את הזנב כלפיך כך שהוא עטוף קלות על האצבע המורה והחזיק נגד הפנימי של האצבע על ידי האגודל. זהה את הוורידים הזנב ממוקם משני צידי הזנב זקוף. ויזואליזציה היא בהנחייתם של ההתחממות הזנב במים חמימים, ולאחר מכן מנגב עם אתנול.

ד הזרקה של תאים

כאשר וריד אותר, הכנס את המזרק שפוע בצד למעלה במקביל זווית רדוד אל הווריד. פעם הוריד, בעדינות לוחץ על המתג, אם אתה בווריד לא צריכה להיות התנגדות הזריקה. אם קיימת התנגדות כלשהי, הסר את המזרק ונסה שוב במיקום שונה.

אם אתה בווריד, לאט לוחץ על המתג עד הזריקה תושלם. הזנב לא צריך להיות נפוחה במהלך ההזרקה. אם כן, פירוש הדבר יהיה כי המחט לא בתוך הווריד. אפשר "לאבד" את הווריד במהלך ההזרקה. אם זה יקרה, להסיר את המחט לנסות זריקה שלך במקום אחר. אם אתה צריך יותר ניסיון זריקה אחת, עדיף להעביר את הזנב כלפי מעלה, אל הגוף של העכבר מאתר ההזרקה המקורית. תכנן קדימה לאפשרות זו על ידי הפעלת distally על הזנב לתת לעצמך מקום ניסיון נוסף בבית להעביר את המאמץ.

ה לאחר הזרקת שיקולים

לאחר הזרקת הושלמה, קטן לאחור זרימת הדם מהעורק תתרחש. לחץ בעדינות באתר ההזרקה עם נקי לנגב עד עוצר דימום. הסר את הבוכנה ולתת לחיה ללכת קדימה, מתוך עוצר, בעוד בעדינות ולהחזיק הזנב.

יש לבדוק תמיד עם ועדת שלך לטיפול בבעלי חיים להשתמש בפרוטוקולים בעלי חיים כדי להבטיח שאתה עומד בדרישות. חשוב לתרגל את הטכניקה הזו מספר פעמים לפני שאתה מנסה את הניסוי האמיתי.

2. הלימפה בידוד

בידוד של בלוטות לימפה הדמיה פוטון two דורש הסרה זהירה של הצומת לימפה הנכונה מן הרקמה הסובבת.

א הבחירה והמיקום של בלוטות הלימפה ההיקפית

בחירה של בלוטות הלימפה הדמיה יהיה תלוי מטרות הניסוי. היו מודעים לזיהום מקומי או הזרקת ניקוז בלוטות הלימפה, ובחר את הצומת המתאימה הדמיה. מאמרו של ואן דן Broeck et al. מתארת ​​את המיקום המורפולוגיה של בלוטות הלימפה Murine בפירוט ^3. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את כריתה של שש בלוטות לימפה גדולה הפריפריה אשר מתאימים בידוד תא או הדמיה.

ב הסרת בלוטת לימפה:

זכור את שלמות הרקמה תוך הסרת בלוטות הלימפה. היזהר שלא לקרוע את הקפסולה או נזק בכל דרך המבנה הלימפה. הפסד של שלמות מבנית לימפה הצומת תתפשר על הניסוי. במידת הצורך, להסיר שומן מפני השטח הלימפה עם מלקחיים לנתח (# 5 דומון) קנס תחת מיקרוסקופ לנתח. בלוטות הלימפה לא צריך שום שומן שנותרו על פני השטח של הצומת, כמו זה יהיה לטשטש הדמיה על ידי פיזור האור.

פרופר כריתה של בלוטות הלימפה היא גם טכניקה חשוב להתאמן לפני הניסוי האמיתי הראשון.

3. לימפה נודדואר הדמיה ההתקנה ושיקולים

קשר הלימפה צריך להיות מאובטח לשלב הדמיה, אשר במקרה זה כולל חדר הפסקה. התחמם, חמצן perfused התקשורת נשאבים אל תוך החדר מצד אחד באמצעות משאבת peristaltic ואת דוד מוטבעות, והוא יוצא דרך ערוץ יורד ציון לתוך תא איסוף עם צינור ואקום בבקבוק איסוף פסולת. במערכת שלנו, הצומת לימפה הוא שקוע 37 ° C מדיה סופר perfused עם רפואי כיתה carbogen (5% CO _2, 95% O _2). הטמפרטורה של התקשורת זלוף יש לרשום קרוב הצומת לימפה האפשר. המערכת הספציפית שלך עשויים לדרוש שינויים בקצב זרימת מדיה ועיצוב הבמה כדי להכיל את שלב המיקרוסקופ ואובייקטיבי.

א הדמיה לימפה הצומת ההתקנה:

כפי שניתן לראות בסרטון, אנחנו לאבטח את הלימפה הראשון על ידי הצמדתו, לשד בצד למטה (לתמונה T או אזורי B התא באמצעות מיקרוסקופ זקוף) כדי coverslip פלסטיק, לחתוך לגודל המתאים. חשוב להשתמש בדבק לא רעיל רקמות (אנו משתמשים VetBond ™ מבית 3M Corporation).

Coverslip מובטחת בתקשורת זורם ידי הצבת טיפה קטנה של שמן סיליקון על החלק התחתון של להחליק את המכסה, אז דבקות זו לבסס את הזכוכית של חדר הדמיה.

ב 2-Photon הדמיה שיקולים:

מספר גורמים יכולים לגרום לימפוציטים לעצור נע: טמפרטורה כי הוא גבוה מדי או נמוך מדי; כוח לייזר עודף; דחיסה או נזק אחר אל הצומת לימפה, וחוסר חמצן. נזק שייגרם עקב כוח לייזר או טמפרטורות מוגזמות> ~ 39 ° C הוא בלתי הפיך.

אם התאים עמומים, הוא בדרך כלל טוב יותר כדי להגדיל את הרווח או גלאי פרוטוקול התא תיוג ולא באמצעות כוח לייזר גבוה יותר לדמיין תאים. אופטימיזציה של תיוג או ביטוי של חלבונים ניאון ייתכן שיהיה צורך להביא את הקרינה מעל לרמה של autofluorescence רקע. עם רווח סביר וכוח הגדרות לייזר, על משמרת שני יומן של הקרינה מעל הבסיס (נמדד על ידי cytometry זרימה) הוא סביר להדמיה התא.

עם שני הפוטונים לייזרים מתכונן, אורך הגל המשמש עירור צריך להיות קצת פחות מהמקסימום כפול פוטון יחיד עירור של fluorophore עתה הדמיה. בשני ניסויים באמצעות פוטון יותר מתווית אחת או חלבון פלואורסצנטי ייתכן שיהיה צורך להתנסות עם גל עירור להשתמש כדי למצוא את הגדרות אופטימלי עבור תוויות שניהם. עירור שני פוטונים יכולים לשמש גם למבנים תמונה אנדוגני קולגן על ידי ניצול של הדור כחול פנימי הרמוני השני. דור הרמונית השני (SHG) מתרחשת שם שני פוטונים משולבים בתוך חומר פולטים פוטון יחיד של תדר כפול של פוטונים המקורי. בתוך הרקמה, שני הפוטונים עירור מתרחשת כאשר אור לייזר האירוע ניצב מבנה חלבון הורה מאוד כגון קולגן.

בעיות מעשיות לגבי שני הפוטונים הדמיה נדונו תצוגה מקדימה ביקורות ^{4, 5.}

Discussion

בפרוטוקול וידאו זה אנו מציגים את ההליכים להעברת תא המאמצים הלימפה בידוד והכנת הנדרש תנועתיות הלימפוציטים הדמיה לימפה היקפי. שני הפוטונים הדמיה יש מספר יתרונות על פני הדמיה confocal בשתי רקמות explanted (ראה כאן) בהכנות intravital. יש לציין, השימוש עירור אינפרא אדום ממזער פיזור אור ומאפשר הדמיה ~ 300 מיקרומטר מתחת הקפסולה של הצומת לימפה עמוק בתוך כמה רקמות ^4. יתר על כן, רב פוטון עירור מוגבל לנקודת המוקד של המטרה, תוך מזעור צילום הלבנת נזק לרקמות את הצד של המטוס מוקד. כמו עם כל הטכניקה החדשה, לעומת זאת, שני הפוטונים הדמיה אינה תרופת פלא ואת המגבלות שלה ואת החסרונות פוטנציאל יש לזכור ^5. בין אלה הוא הדרישה כי - למעט אותות מהותי כגון הדור השני הרמוני על ידי קולגן תאים עניין חייב להיות שכותרתו fluorescently על ידי בדיקות חיצוני או על ידי ביטוי של חלבונים ניאון. הרושם שנוצר ובכך כי תאים אלה שכותרתו שוחים בחלל השחור, ואילו לאמיתו של דבר הם שקועים, וליצור אינטראקציה עם הסביבה מורכבת של אלמנטים מבניים עצום אחרים ללא תווית, תאים בלתי נראה.

בשש השנים מאז כניסתה של הדמיה שני פוטונים על באימונולוגיה, טכניקה זו אפשרה לחוקרים כתובת ארוכת שאלות ישירות על ידי הדמיה של רקמות שלמות תהליכי החיים, כולל תאים תאים אינטראקציות, תנועתיות התא ולוקליזציה, מסלולי איתות הסלולר תאים ציטוטוקסיים הרג האירועים. התחום התפתח במהירות מעבר לתיאורים הפנומנולוגית הראשונית, ניתוחים כמותיים יחד עם דוגמנות המחשב וסימולציה עכשיו מתחילים להבין איך תנועות הסלולר כאוטית לכאורה ואת האינטראקציות בתוך בלוטות הלימפה להוביל תגובה חיסונית יעילה. התקדמות זו היא בדיקה מקיפה בפרסום האחרונות ^1, אשר מונה מעל 100 מאמרים המתארים את היישום של מיקרוסקופיה שני פוטונים עבור immunoimaging.