Summary
双光子成像内已发现的基础条件下的淋巴结和淋巴细胞的活力和细胞相互作用过程中的免疫反应1。在这里，我们证明收养的T细胞，淋巴结的隔离和成像蠕动的CD4 + T细胞在explanted淋巴结转移。
Abstract
双光子成像揭示了一个优雅的芭蕾舞蹈艺术的活力和细胞相互作用，在基础条件下的淋巴结，并启动免疫反应1。在这里，我们目前继转移标记的T细胞，淋巴结肿大隔离，成像蠕动的CD4 + T细胞在explanted淋巴结作为第一个在2002年2的方法。双光子成像需要的免疫细胞，细胞荧光标记，与细胞跟踪染料染色，或表达一种荧光蛋白。我们展示的注射细胞过继转移的过程，从供体小鼠的尾静脉进入收件人的动物，在那里，他们家约15-30分钟内淋巴器官。我们说明了一个淋巴结的隔离和描述方法，以确保正确安装切除淋巴结。其他考虑因素，如适当的氧合灌注介质，温度，激光功率进行了讨论。最后，我们目前的3D视频影像的幼稚CD4 + T细胞参展稳态活力在37 ° C。
Protocol
1。细胞过继转移：
尾静脉或眼内注射引入细胞的跟踪标记或荧光蛋白表达的淋巴细胞都合适的方法。在这个视频。我们展示了尾静脉注射的细胞过继转移。
A.材料
CD4 + T细胞与1.4μm的30分钟37 ° C CFSE标记，洗涤两次，重悬在100μL的RPMI - 1640。细胞被装入一个无菌的28针注射胰岛素的注射器。正在做实验使用的细胞数量取决于。通常情况下，5万T细胞是够简单的T细胞的可视化。需要一个鼠标灭鼠限位，以防止受伤的动物和自己。
B.保护动物
鼠标是继转移担保慢慢备份到啮齿类动物限位的动物（见视频）和关闭的钢管的开口端，轻轻按下柱塞。不要让去的老鼠尾巴，在此过程中，一些较小的动物可以打开里面的限位。这种方法可以防止伤害自己和在注射的动物。成立灭鼠限位时，不推进一步柱塞比是要不断向前跳跃的动物。此外，不推柱塞对动物，和不留在限位长时间的动物。
C.尾静脉可视化
轻轻拉出，以便它轻轻地包裹在你的食指和你的拇指对手指内举行对你的尾巴。确定位于直立的尾巴两侧上的尾静脉。可视化是促进变暖尾用温水，然后用乙醇擦拭。
D.注射细胞
当已经找到静脉，插入注射器的锥端，在一个浅的角度平行静脉。一旦在静脉，轻轻压下柱塞，如果你在静脉应注射无阻力。如果有任何抵抗，取下注射器，并在不同的位置后再试一次。
如果你在静脉，慢慢地压低活塞，直到注射完成。尾巴不应该成为在注射肿胀。如果确实如此，这将意味着，在静脉针。这是可能的“输”在静脉注射。如果发生这种情况，去掉针头，并尝试在不同部位注射。如果你需要尝试超过一次注射，最好是迈向鼠标身体的尾巴从原来的注射部位。这种可能性的计划提前启动远端的尾巴上给自己另一个企图在继转移的房间。
E.注射后注意事项
注射完毕后，将出现一个小的静脉血液的回流，从。轻轻按下注射部位，用干净的擦，直到出血停止。取出柱塞，让动物向前走，走出了限位，一边轻轻控股尾巴上。
请务必检查您的动物保健委员会和动物使用的协议，以确保您遵守。重要的是实践这项技术，真实的实验，然后再尝试几次。
2。淋巴结隔离
两个光子成像淋巴结分离需要小心正确的淋巴结周围组织切除。
A.选择和周围淋巴结的位置
成像淋巴结的选择将取决于实验的目标。局部感染或注射淋巴结，并选择适当的节点成像。由Van登布洛克等文章，介绍了3详细的小鼠淋巴结的位置和形态。在这段视频中，我们展示了六个大型的外周淋巴结，这是适合于细胞的分离或成像切除。
B.淋巴结清除：
记住组织的完整性，同时消除淋巴结。要小心，不要胶囊破裂或以任何方式损害淋巴结结构。淋巴结的结构完整性的丧失会危及实验。如有必要，删除解剖（＃5杜蒙）在解剖显微镜下用细钳从淋巴结表面脂肪。淋巴结不应该有任何节点表面上剩余的脂肪，因为这会掩盖散射光成像。
适当切除淋巴结也是一个重要的技术，实践前的第一个真正的实验。
3。淋巴结的Nod发送图像的设置和注意事项
应保证成像阶段，在这种情况下由一个凹腔淋巴结。温暖，氧气灌注媒体是从一个侧面，用蠕动泵室和内联加热器，泵入和退出真空管废物收集烧瓶通过向下分级进入收集室通道。在我们的系统，淋巴结被淹没在37 ° C媒体和医疗级carbogen（5％，95％的CO 2，O 2）超灌注。灌注介质的温度应尽可能接近淋巴结记录。您的特定系统的，可能需要在媒体流量和舞台设计的变化，以适应显微镜阶段和客观。
A.淋巴结成像设置：
在视频所示，我们安全第一附加的淋巴结，髓质的一面朝下（图像T或B细胞区使用一个直立显微镜），切成适当大小的塑料盖玻片。重要的是要使用无毒的组织胶（我们使用3M公司VetBond™）。
在流动媒体是安全的盖玻片盖玻片底面放置在一个小民建联硅脂，然后坚持这种成像室的玻璃基板。
B.双光子成像的考虑：
有几个因素可能会导致细胞停止移动：温度过高或过低的激光功率过剩，压缩或者其他损害的淋巴结;和缺乏氧气。由于激光功率过高或温度所造成的损坏>〜39 ° C是不可逆转的。
如果细胞是暗淡的，它通常是更好的增加探测器的增益，而不是使用一个更高的激光功率可视化细胞的细胞标记协议。优化标签或荧光蛋白的表达，可能需要把上述背景自发荧光的水平的荧光。有了合理的增益和激光功率设置日志基线以上的荧光转变，流式细胞仪检测细胞可视化的合理。
可调谐双光子激光器，激发波长应少一点一倍以上的单光子激发荧光成像的最大。在使用一个以上的标签或荧光蛋白的双光子实验，它可能是要用来寻找最佳设置两个标签的激发波长的实验。双光子激发，也可以用于图像的内源性胶原蛋白结构的内在蓝色的二次谐波产生的优势。二次谐波（SHG）发生在两个光子在材料相结合，并发出两倍于原来的光子的频率的单光子。在组织中，发生双光子激发时，入射激光光线垂直于一个高度有序的蛋白质结构，如胶原蛋白。
在预览评论4，5，关于双光子成像的实际问题进行了讨论。
Discussion
在这个视频协议，我们将展示收养细胞转移和淋巴结成像在周围淋巴结淋巴细胞活力所需的隔离和准备程序。双光子成像有几个方面的共焦成像的优势，都explanted组织（如图所示），并在活体准备。值得注意的是，使用红外线激发，减少了光散射和淋巴结的囊下的成像〜300微米，允许在一些组织4更深。此外，多光子激发被限制的客观的焦点，最大限度地减少照片的褪色和组织损伤出方焦平面。然而，正如任何新技术，双光子成像是不是万能的，它的局限性和潜在的隐患，必须保持头脑5。其中之一是，要求 - 除了利益的胶原蛋白细胞，如二次谐波产生的内在信号必须由外在探头荧光标记或荧光蛋白的表达。因此，给人的印象是这些标记的细胞在一个黑色的虚空游泳;而事实上，他们都沉浸在和一个复杂的环境中的结构元素和无数其他的未标记的，无形的细胞交互。
在双光子成像介绍免疫以来的六年中，这种技术允许研究人员直接在可视化的完整的活组织的过程，包括细胞间的相互作用，细胞运动和本地化，细胞信号通路和细胞毒性细胞，以解决长期存在的问题杀害事件。领域已经超出最初的现象学描述的迅速发展，并与计算机建模和仿真定量分析，现在开始做出显然是混乱的蜂窝议案和淋巴结内的相互作用如何导致一个有效的免疫反应的的感觉。这种进步是全面检讨在最近出版的1，它列出了100多个描述双光子显微镜的immunoimaging应用程序文件。
Acknowledgments
我们要感谢协助试剂制备丽贝卡Paquette。 MPM是一个露丝L. Kirchstein predoctoral奖学金的赠款GM - 41514（MDC），NS - 48252（KGC），GM - 48071也从美国国立卫生研究院（IP）的健康和支持国家机构的支持。
References
- Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of Cell Motility and Interaction Dynamics Imaged by Two-Photon Microscopy in Lymphoid Organs. Annu Rev Immunol. Annu Rev Immunol. , (2008).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
- Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. J Immunol Methods. 312, 12-19 (2006).
- Cahalan, M. D., Parker, I., Wei, S. H., Miller, M. J. Two-photon tissue imaging: seeing the immune system in a fresh light. Nat Rev Immunol. 2, 872-880 (2002).
- Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise. Nat Rev Immunol. 6, 497-507 (2006).
