Dissezione e 2-Photon Imaging di linfonodi periferici nei topi

Summary

Due fotoni di imaging ha scoperto la motilità dei linfociti e interazioni cellulari all'interno del linfonodo in condizioni basali e durante una risposta immunitaria ^1. In questo studio dimostriamo trasferimento adottivo di cellule T, l'isolamento dei linfonodi, e la motilità imaging di cellule T CD4 + nel linfonodo espiantati.

Abstract

Due fotoni di imaging ha rivelato una coreografia elegante della motilità e interazioni cellulari all'interno del linfonodo in condizioni basali e l'avvio di una risposta immunitaria ^1. Qui, vi presentiamo i metodi per il trasferimento adottivo di cellule T etichettati, l'isolamento dei linfonodi, e la motilità imaging di cellule T CD4 + nel linfonodo espiantati come descritto per primo nel 2002 ^2. Immagini a due fotoni di cellule immunitarie richiede che le cellule sono marcate, sia per colorazione con un colorante inseguitore cellulare o esprimendo una proteina fluorescente. Dimostriamo la procedura di trasferimento adottivo di cellule derivate da topi iniettando donatore nella vena della coda di un animale destinatario, dove hanno sede gli organi linfoidi in circa 15-30 min. Illustriamo l'isolamento di un linfonodo e descrivono metodi per assicurare un corretto montaggio del linfonodo asportato. Altre considerazioni, quali una corretta ossigenazione dei media perfuso, la temperatura e potenza del laser sono discussi. Infine, vi presentiamo le immagini video in 3D di CD4 + cellule T naive espositrici motilità allo stato stazionario a 37 ° C.

Protocol

1. Trasferimento adottivo di cellule:

Vena caudale o iniezione intraoculare sono entrambi metodi adeguati per l'introduzione di cellule tracker-etichettati o proteina fluorescente che esprimono linfociti. In questo video. dimostriamo trasferimento adottivo di cellule per iniezione coda vena.

a. Materiale

Cellule T CD4 + sono etichettati con 1,4 CFSE mM per 30 minuti a 37 º C, lavate due volte e risospese in 100 ml di RPMI-1640. Le cellule vengono caricati in una siringa da insulina sterile 28 gauge per l'iniezione. Il numero di celle utilizzate dipende l'esperimento viene fatto. Tipicamente, 5 milioni di cellule T sono sufficienti per una semplice visualizzazione delle cellule T. Un dispositivo di immobilizzazione roditore per il mouse è necessaria per evitare danni per l'animale e per te stesso.

b. Protezione degli animali

Il mouse è fissato per il trasferimento adottivo lentamente appoggio l'animale nel dispositivo di immobilizzazione roditori (vedi video) e chiudere l'estremità aperta del tubo delicatamente lo stantuffo. Non lasciare andare la coda di topo durante questo processo, come alcuni animali più piccoli può girare intorno all'interno del dispositivo di immobilizzazione. Questo metodo impedisce l'animale da ferire se stesso e di muoversi durante l'iniezione. Durante l'installazione del dispositivo di immobilizzazione roditore, non spingere il pistone in là di quanto necessario per mantenere l'animale dal salto in avanti. Inoltre, non spingere il pistone contro l'animale, e non lasciare l'animale nel dispositivo di immobilizzazione per un periodo prolungato di tempo.

c. Visualizzazione della vena caudale

Tirare delicatamente la coda verso di voi in modo che sia leggermente avvolto sopra il dito indice e tenuto contro l'interno del dito con il pollice. Identificare le vene coda situate ai due lati della coda verticale. La visualizzazione è facilitato dal riscaldamento della coda con acqua calda e pulendoli giù con etanolo.

d. L'iniezione di cellule

Quando la vena è stato localizzato, inserire la siringa conica rivolta verso l'alto ad un parallelo angolo basso alla vena. Una volta in vena, lentamente spingere il pistone, se siete in vena ci dovrebbe essere alcuna resistenza all'iniezione. Se non vi è alcuna resistenza, rimuovere la siringa e riprova in una posizione diversa.

Se siete in vena, lentamente spingere il pistone fino a quando l'iniezione è completa. La coda non deve diventare disteso durante l'iniezione. Se lo fa, ciò significherebbe che l'ago non è in vena. E 'possibile "perdere" la vena durante l'iniezione. In questo caso, rimuovere l'ago e provare l'iniezione in un punto diverso. Se avete bisogno di tentare più di una iniezione, è meglio spostare la coda in alto verso il corpo del mouse dal sito di iniezione originale. Pianificare in anticipo per questa possibilità a partire distalmente sulla coda per darti spazio per un altro tentativo di trasferimento adottivo.

e. Post-iniezione considerazioni

Dopo l'iniezione è stata completata, un piccolo riflusso di sangue dalla vena si verificherà. Premere delicatamente il sito di iniezione con un panno pulito, pulire fino a quando il sanguinamento si arresta. Togliere lo stantuffo e lasciare che l'animale camminare in avanti, fuori dal dispositivo di immobilizzazione, mentre delicatamente aggrappato alla coda.

Verificate sempre col vostro comitato animali cura e protocolli di utilizzare animali per garantire che siano conformi. E 'importante praticare questa tecnica più volte prima di tentare l'esperimento vero e proprio.

2. Linfonodale isolamento

Isolamento dei linfonodi per due immagini fotoni richiede la rimozione accurata del linfonodo corretta dal tessuto circostante.

a. Selezione e l'ubicazione dei linfonodi periferici

Selezione dei linfonodi per l'imaging dipenderà dagli obiettivi sperimentali. Essere a conoscenza di infezione locale o iniezione-drenante linfonodi, e selezionare il nodo appropriato per l'imaging. L'articolo di Van den Broeck et al. Descrive la posizione e la morfologia dei linfonodi murini in dettaglio ^3. In questo video, ci dimostrano l'asportazione di sei grandi nodi linfatici periferici che sono adatti per l'isolamento di cellule o di imaging.

b. Linfonodale rimozione:

Tenete a mente l'integrità del tessuto durante la rimozione dei linfonodi. Fare attenzione a non rompere la capsula o in qualsiasi modo danneggiare la struttura dei linfonodi. Perdita di integrità strutturale del linfonodo comprometterà l'esperimento. Se necessario, rimuovere il grasso dalla superficie del linfonodo con multa dissettore (# 5 Dumont) sotto un microscopio da dissezione. I linfonodi non dovrebbe avere alcun grasso residuo sulla superficie del nodo, in modo da oscurare imaging dispersione della luce.

Escissione corretta dei linfonodi è anche una tecnica importante per la pratica prima del primo esperimento reale.

3. Linfa NodImaging e installazione e considerazioni

Il linfonodo deve essere assicurato alla fase di imaging, che in questo caso consiste in una camera di incasso. Riscaldato, ossigeno perfusi media è pompato nella camera da un lato utilizzando una pompa peristaltica e riscaldatore in linea, ed esce attraverso un canale verso il basso classificato in una camera di raccolta con un tubo a vuoto in un pallone di raccolta dei rifiuti. Nel nostro sistema, il linfonodo è immerso in 37 ° C media e super-perfusi con medici di grado CarboGen (5% CO _2, 95% O _2). La temperatura dei media perfusione dovrebbero essere registrati come vicino al linfonodo come è possibile. Il vostro sistema particolare può richiedere variazioni della portata media e scenografia per ospitare la fase di microscopio e obiettivo.

a. Linfonodi configurazione di imaging:

Come mostrato nel video, siamo sicuri del linfonodo dal primo allegando, midollare rivolto verso il basso (per l'immagine T o zone a cellule B mediante un microscopio verticale) ad un coprioggetto di plastica, tagliato a misura appropriata. E 'importante utilizzare una colla non tossica dei tessuti (usiamo VetBond ™ di 3M Corporation).

Il coprioggetto è fissato nei media che scorre mettendo una goccia di grasso al silicone sulla parte inferiore del vetrino, poi aderendo questo alla base in vetro della camera di imaging.

b. 2-Photon Imaging considerazioni:

Diversi fattori possono causare linfociti per fermare in movimento: temperatura troppo alta o troppo bassa; potenza del laser in eccesso; compressione o altri danni ai linfonodi, e la mancanza di ossigeno. Danni dovuti ad eccessiva potenza del laser o temperature> ~ 39 ° C è irreversibile.

Se le cellule sono debole, che è meglio per aumentare il guadagno del rivelatore o la cella di etichettatura protocollo piuttosto che utilizzare un laser di potenza superiore per visualizzare le cellule. Ottimizzazione di etichettatura o espressione di proteine ​​fluorescenti può essere richiesto per portare la fluorescenza al di sopra del livello di autofluorescenza di fondo. Con guadagno ragionevole e le impostazioni di potenza del laser, circa un due di turno della fluorescenza di sopra del basale (misurato mediante citometria di flusso) è ragionevole per la visualizzazione della cella.

Sintonizzabile con due fotoni laser, la lunghezza d'onda utilizzata per l'eccitazione dovrebbe essere un po 'meno del doppio del singolo fotone massima eccitazione del fluoroforo essere ripreso. In due-fotone esperimenti usando più di una etichetta o proteina fluorescente che può essere necessario sperimentare con la lunghezza d'onda di eccitazione utilizzato per trovare le impostazioni ottimali per entrambe le etichette. Eccitazione a due fotoni può essere utilizzato anche per le strutture collagene endogeno immagine sfruttando le intrinseche blu generazione di seconda armonica. Generazione di seconda armonica (SHG) si verifica quando due fotoni si combinano all'interno di un materiale ed emettere un singolo fotone del doppio della frequenza dei fotoni originale. Nel tessuto, a due fotoni di eccitazione si verifica quando la luce laser incidente è perpendicolare ad una struttura proteica altamente ordinata come il collagene.

Questioni pratiche relative a due fotoni di imaging sono stati discussi in anteprima su ^{4, 5.}

Discussion

In questo protocollo video vi mostriamo le procedure per il trasferimento di cellule adottivi e nodo isolamento linfa e la preparazione necessaria per la motilità dei linfociti di imaging in un linfonodo periferico. Due fotoni di imaging ha diversi vantaggi rispetto di imaging confocale in entrambi i tessuti espiantati (qui) e nei preparati intravitale. In particolare, l'uso di raggi infrarossi eccitazione riduce al minimo la dispersione della luce e permette l'imaging con ~ 300 micrometri sotto la capsula del linfonodo e più profondo in alcuni tessuti ^4. Inoltre, multi-fotone di eccitazione è limitato al punto focale dell'obiettivo, riducendo al minimo lo sbiancamento foto e danni ai tessuti da parte del piano focale. Come per ogni nuova tecnica, invece, a due fotoni imaging non è una panacea e suoi limiti e le insidie ​​potenziali devono essere tenuti a mente ^5. Tra questi è il requisito che - ad eccezione dei segnali intrinseci quali di seconda generazione armonica di collagene le cellule di interesse devono essere marcate con sonde estrinseci o per espressione di proteine ​​fluorescenti. L'impressione è così creato che queste cellule marcate sono il nuoto in un vuoto nero e che in realtà sono immersi in, e interagire con un ambiente complesso di elementi strutturali e una miriade di altri senza etichetta, le cellule invisibili.

Nei sei anni dall'introduzione di due fotoni di imaging per l'immunologia, questa tecnica ha permesso ai ricercatori di affrontare annose domande da visualizzare direttamente nei processi intatti i tessuti viventi compresi interazioni cellula-cellula, la motilità cellulare e la localizzazione, vie di segnalazione cellulare e cellule citotossiche uccidendo eventi. Il campo si è rapidamente evoluta al di là iniziale descrizioni fenomenologiche, e le analisi quantitative con modelli al computer e simulazione stanno iniziando a dare un senso di come i movimenti apparentemente caotici cellulare e le interazioni all'interno di linfonodi portare ad una risposta immunitaria efficace. Questo progresso è a un riesame in una recente pubblicazione ^1, che elenca oltre 100 articoli che descrivono l'applicazione della microscopia a due fotoni per immunoimaging.