解剖とマウスの末梢リンパ節の2 - フォトンイメージング

Summary

二光子イメージングには、基礎条件の下でリンパ節内および免疫応答^1の間にリンパ球運動と細胞間相互作用を明らかにした。ここで、我々はT細胞、リンパ節の分離、およびCD4 +植リンパ節におけるT細胞のイメージング運動の養子移入を示しています。

Abstract

二光子イメージングには、基礎条件の下でリンパ節内および免疫応答¹の開始時の運動性と細胞間相互作用の優雅な振り付けを明らかにした。ここで、我々は、標識されたT細胞、リンパ節の分離、およびCD4 + 2002年²で説明したように植リンパ節におけるT細胞のイメージング運動の養子移入するための方法を提示する。免疫細胞の二光子励起イメージングは​​、細胞を蛍光セルトラッカーの色素で染色することによりまたは蛍光タンパク質を発現するかして、ラベル付けされている必要があります。我々は、約15-30分内リンパ器官には、自宅レシピエント動物の尾静脈にドナーマウス由来の細胞を注入するの養子移入の手順を示しています。我々はリンパ節の分離を示し、摘出したリンパ節の実装を適切に確保するための方法を説明します。このような適切な灌流メディアの酸素、温度、およびレーザパワーのような他の考慮事項が説明されています。最後に、我々はナイーブCD4の3D映像+ 37℃で定常状態の運動性を示すT細胞を提示℃に

Protocol

1。細胞の養子移入：

尾静脈または眼内注射は、細胞の導入トラッカー標識または蛍光タンパク質を発現するリンパ球の両方に適した方法である。このビデオで。我々は、尾静脈注射によって細胞の養子移入を示しています。

A.材料

CD4 + T細胞を37℃で30分間、1.4μMのCFSEで標識されていますが、2回洗浄し、RPMI - 1640の100μLに再懸濁した。細胞は、無菌の注射用28ゲージのインスリン注射器にロードされます。使用する細胞の数は、実験が行われているに依存します。通常は、500万T細胞は、単純なT細胞の可視化のために十分です。マウスのための齧歯類の現像抑制剤は、動物に、自分自身への負傷を​​防止するために必要とされる。

B.動物の保護

マウスをゆっくり（ビデオを参照）げっ歯類の制止する人に動物をバックアップし、静かにプランジャーを押すことにより管の開放端を閉じることによって養子移入のために確保される。いくつかの小さな動物が制止する人の内部に好転することができるように、このプロセスの間にマウスの尾から行くようにしてください。このメソッドは、自分自身を傷つけるからと注入中に移動するから動物を防ぐことができます。げっ歯類の現像抑制剤をセットアップするとき、前方にジャンプするから動物を保つために必要であるよりも、さらににプランジャーを押さないでください。また、動物に対してプランジャーを押したりしないで、そして時間の長時間制止する人に動物を放置しないでください。

C.尾静脈の可視化

軽く軽く、人差し指を介してラップし、親指で指の内側に対して保持されるようにあなたに向かって尾を引く。直立テールのどちらかの側にある尾静脈を識別します。可視化は、その後、エタノールでダウン拭き取り、ぬるま湯で尾を暖めることによって促進される。

D.細胞の注入

静脈が位置しているときは、静脈に浅い角度で平行にシリンジのベベル面を上に挿入する。一回静脈内、静かにプランジャーを押し下げて、あなたが静脈にある場合は注射への抵抗はないはずです。何らかの抵抗がある場合は、シリンジを取り外して、別の場所でもう一度試してください。

あなたが静脈内にある場合、注入が完了するまで、ゆっくりとプランジャーを押し下げる。尾は、注入時に膨張になってはいけません。その場合、これは針が静脈内にないことを意味します。注入中に静脈を"失う"ことが可能です。このような場合は、針を取り外して、別の場所で注射をしてみてください。複数の注射をしようとする必要がある場合、それはオリジナルの注射部位からのマウスの体に向かって尾を上下に移動するのが最善です。養子移入におけるもう一つの試みのために自分で部屋を与えるためにテールに遠位に起動して、この可能性のために将来の計画を立てる。

E.ポスト噴射の考慮事項

注入が完了した後、静脈からの血液の小さな逆流が発生します。静かに出血が停止するまでクリーンワイプで注射部位を押してください。プランジ​​ャーを外し、ゆっくりと尾部に保持している間、動物は、制止​​する人のうち、前方に歩いてみましょう。

常にあなたが従っているを確認するために、動物のケア委員会および動物使用のプロトコルを確認してください。実際の実験を試みる前に、このテクニックを数回練習することが重要です。

2。リンパ節の分離

二光子イメージングのためのリンパ節の分離は、周囲の組織から適切なリンパ節を慎重に除去する必要があります。

A.選択し、末梢リンパ節の位置

イメージングのためのリンパ節の選択は、実験目的に依存します。局所感染または射出所属リンパ節に注意してください、とイメージングのための適切なノードを選択します。ヴァンデンブルークらの論文は。、詳細³のマウスリンパ節の位置と形態を説明しています。このビデオでは、我々は細胞の分離やイメージングに適している6大末梢リンパ節の切除を示しています。

B.リンパ節の除去：

リンパ節を除去しながら心に組織の整合性を保つ。しない破裂カプセルを、または任意の方法の損傷リンパ節の構造に注意してください。リンパ節の構造的完全性の損失は、実験が損なわれます。必要に応じて、解剖顕微鏡下で解剖細かい（＃5デュモン）ピンセットでリンパ節の表面から脂肪を取り除く。リンパ節は、これは光を散乱によるイメージングを覆い隠すので、ノードの表面上に残りの脂肪を含んではならない。

リンパ節の適切な切除はまた、最初の本当の実験の前に練習する重要な手法です。

3。リンパノッド電子イメージングセットアップと注意事項

リンパ節は、この場合には埋め込み式のチャンバーから構成される画像処理の段階、に保護する必要があります。暖め、酸素灌流メディアは、蠕動ポンプとインラインヒーターを使用して1つの側面からチャンバーにポンプでくまれ、そして廃棄物収集フラスコに真空管と収集チャンバ内へ下降傾斜チャネルを介してそれが終了します。私たちのシステムでは、リンパ節は、Cメディアは、37℃で浸漬されており、医療グレードのcarbogen（5％CO _{2、95％O 2）}と超灌流。可能な限りそのまま灌流媒体の温度は、リンパ節の近くに記録されるべきである。特定のシステムでは、メディアの流量と舞台デザインのバリエーションは、顕微鏡ステージと客観的に対応するために必要となる場合があります。

A.リンパ節イメージングセットアップ：

としてビデオに示すように、我々は適切なサイズにカットプラスチックカバースリップに（正立顕微鏡を使用して画像TまたはB細胞のゾーンへの）ダウン髄質側は、最初にそれを添付してリンパ節を固定します。無毒の組織接着剤を（我々は3M社からVetBond™を使用する）使用することが重要です。

カバースリップは、イメージングチャンバーのガラスのベースにこれを付着、カバースリップの下側にシリコーングリースの小さい軽打を配置することによって、流れる媒体に固定されています。

B. 2光子イメージングの考慮事項：

いくつかの要因は、リンパ球が動いて停止することができます：高すぎるまたは低すぎる温度、過剰なレーザーパワー、圧縮またはリンパ節へのその他の損傷、及び酸素の欠乏を。過度のレーザパワーや温度による損傷>〜39℃の不可逆的である。

細胞が薄暗いであれば、それはむしろ、細胞を可視化するためにより高いレーザパワーを使用するよりも検出器のゲインまたは細胞標識のプロトコルを増加させるほうがベターです。蛍光タンパク質のラベルまたは式の最適化は、バックグラウンドの自家蛍光のレベル以上の蛍光をもたらすために必要となる場合があります。合理的なゲインおよびレーザパワーの設定では、ベースライン上の蛍光の約2ログのシフト（フローサイトメトリーで測定した）細胞の可視化のための合理的です。

調整可能な二光子レーザーで、励起に使用される波長は、撮像される蛍光体の二重単一光子励起の最大値より少し小さくする必要があります。複数のラベルまたは蛍光タンパク質を用いて二光子実験ではそれは両方のラベルの最適な設定を見つけるために使用される励起波長を実験する必要があるかもしれません。二光子励起は、本質的な青色の第二高調波発生を利用することによって画像内因性のコラーゲンの構造に使用することができます。第二高調波発生（SHG）は、2つの光子が物質内で結合されている場所で発生し、元の光子の2倍の周波数の単一光子を放出する。組織では、二光子励起では入射レーザー光は、コラーゲンのような高度に秩序化されたタンパク質の構造に垂直な場合に発生します。

二光子励起イメージングに関する実務的な問題は、プレビューのレビュー^4、5で議論された。

Discussion

このビデオプロトコルでは、養子細胞移入と末梢リンパ節のイメージングリンパ球の運動性に必要なリンパ節の分離と準備するための手順を示しています。二光子イメージングには、外植組織（ここに示されている）の両方でと生体製剤における共焦点イメージングに比べていくつかの利点があります。特に、光散乱を最小限に抑え、リンパ節被膜下イメージング〜300マイクロメートルを可能にするといくつかの組織⁴の深い赤外励起の使用。また、多光子励起は、漂白写真と焦点面の側面から組織の損傷を最小限に抑え、目標の焦点に制限されています。あらゆる新技術と同様に、しかし、二光子イメージングは、万能薬ではないとその限界と潜在的な落とし穴が念頭⁵に保持する必要があります。興味のコラーゲン細胞を蛍光外因性のプローブによって、または蛍光タンパク質の発現によってラベル付けされている必要がありますがそのような第二高調波発生などの内因性シグナルを除いて - これらの中でその要件です。真実にそれらがに浸漬されているのに対し、構造要素と無数の他のラベルの付いていない、目に見えない細胞の複雑な環境と相互作用し、印象は、このように、これらの標識細胞が黒色無効に泳いでいることが作成されます。

免疫学への二光子イメージングの導入以来6年で、この手法は、直接細胞間相互作用、細胞の運動性と局在、細胞のシグナル伝達経路と細胞傷害性細胞を含む無傷の生体組織のプロセスで視覚化することによって長年の疑問を解決するための研究を可能にしたイベントを殺す。フィールドは急速に初期の現象論的説明を越えて進化している、とコンピュータモデリングとシミュレーションと一緒に定量分析は、現在、リンパ節内で明らかに混沌とした細胞の動きとの相互作用が効率的な免疫応答を導く方法の意味を理解し始めている。この進展は、総合的にimmunoimagingの2光子顕微鏡のアプリケーションを記述する100以上の論文をリスト最近の出版物¹に見直される。