Dissecção e 2-Photon Imagens de linfonodos periféricos em ratos

Summary

Dois fótons de imagem revelou motilidade linfócitos e interações celulares dentro do nó de linfa em condições basais e durante uma resposta imune ^1. Aqui, demonstramos transferência adotiva de células T, o isolamento dos gânglios linfáticos, e motilidade de imagens de células CD4 + T no linfonodo explantado.

Abstract

Dois fótons de imagens revelou uma coreografia elegante da motilidade e interações celulares dentro do nó de linfa em condições basais e no início de uma resposta imune ^1. Aqui, apresentamos métodos para transferência adotiva de células T rotulados, o isolamento dos gânglios linfáticos, e motilidade de imagens de células CD4 + T no linfonodo explantado como descrita pela primeira vez em 2002 ^2. Imagem de dois fótons de células do sistema imunológico requer que as células são fluorescente etiquetado, seja através da coloração com um corante rastreador celular ou por expressar uma proteína fluorescente. Nós demonstramos o procedimento de transferência adotiva de células derivadas de camundongos injetando doador na veia da cauda, ​​onde o lar de órgãos linfóides dentro de aproximadamente 15-30 min. Destinatário de um animal Ilustramos o isolamento de um nó de linfa e descrever métodos para garantir uma montagem adequada do linfonodo extirpado. Outras considerações, tais como a oxigenação adequada dos meios de comunicação perfundidos, temperatura e potência do laser são discutidas. Finalmente, apresentamos as imagens de vídeo 3D de CD4 + células T ingênuo exibindo motilidade estado de equilíbrio a 37 ° C.

Protocol

1. Transferência adotiva de células:

Veia da cauda ou injeção intra-ocular são métodos adequados para a introdução de células-tracker rotulados ou proteína fluorescente que expressam linfócitos. Neste vídeo. demonstramos transferência adotiva de células por injeção veia da cauda.

a. Materiais

Células T CD4 + são rotulados com 1,4 mM CFSE por 30 minutos a 37 º C, lavados duas vezes, e re-suspenso em 100 mL de RPMI-1640. Células são carregados em uma seringa de insulina estéreis 28 gauge para injecção. O número de células utilizado depende da experiência que está sendo feito. Normalmente, 5 milhões de células T são suficientes para a visualização de células T simples. Um limitador de roedores para o mouse é necessário para evitar danos ao animal e para si mesmo.

b. Protegendo o animal

O mouse é garantido para a transferência adotiva por lentamente apoio do animal para o limitador de roedores (ver vídeo) e fechando a extremidade aberta do tubo delicadamente pressionando o êmbolo. Não deixe de ir a cauda do rato durante este processo, como alguns animais de pequeno porte pode virar-se dentro do limitador. Este método evita que o animal de ferir-se e de mover-se durante a injecção. Ao configurar o limitador de roedores, não empurre o êmbolo para dentro mais longe do que é necessário para manter o animal de saltar para a frente. Além disso, não empurre o êmbolo contra o animal, e não deixar o animal no limitador por um período prolongado de tempo.

c. Visualização da veia da cauda

Puxe o rabo em sua direção para que seja levemente enrolado ao longo do seu dedo indicador e segurou contra o interior do dedo pelo seu polegar. Identificar as veias da cauda localizados em cada lado da cauda na posição vertical. A visualização é facilitada pelo aquecimento da cauda com água morna, em seguida, limpar-se com etanol.

d. Injeção de células

Quando a veia foi localizada, insira a seringa bisel voltado para cima em um ângulo paralelo rasa para a veia. Uma vez na veia, gentilmente o êmbolo, se você está na veia não deve haver nenhuma resistência à injeção. Se houver resistência, retire a seringa e tente novamente em um local diferente.

Se você está na veia, lentamente o êmbolo até que a injeção é completa. A cauda não deve tornar-se distendido durante a injecção. Se isso acontecer, isso significaria que a agulha não está na veia. É possível "perder" a veia durante a injeção. Se isso acontecer, retire a agulha e tentar a sua injeção em um local diferente. Se você precisa tentar mais de uma injeção, o melhor é mover a cauda para cima em direção ao corpo do mouse a partir do local da injeção original. Planejar com antecedência para essa possibilidade, iniciando distalmente na cauda para dar-se espaço para mais uma tentativa de transferência adotiva.

e. Pós-injeção considerações

Após a injeção for concluída, um pequeno refluxo de sangue da veia irá ocorrer. Pressione suavemente o local da injecção com um limpa-wipe até parar de sangrar. Retire o êmbolo e deixe o animal andar para a frente, fora do limitador, enquanto delicadamente segurando a cauda.

Sempre verifique com seu comitê de cuidados com animais e protocolos de uso de animais para garantir que está em conformidade. É importante praticar esta técnica várias vezes antes de tentar a experiência real.

2. Isolamento do Linfonodo

Isolamento dos gânglios linfáticos por dois fótons de imagem requer a remoção cuidadosa do linfonodo correta do tecido circundante.

a. Seleção e localização de linfonodos periféricos

Seleção de linfonodos para imagens vai depender dos objetivos experimentais. Estar ciente de infecção local ou injeção de drenagem dos gânglios linfáticos, e selecione o nó apropriado para imagens. O artigo de Van den Broeck et al., Descreve a localização e morfologia dos gânglios linfáticos murino em detalhe ^3. Neste vídeo, demonstramos a excisão de seis grandes linfonodos periféricos, que são adequados para o isolamento de células ou de imagem.

b. Remoção dos linfonodos:

Tenha em mente a integridade do tecido durante a remoção dos gânglios linfáticos. Tenha cuidado para não romper a cápsula ou em qualquer forma prejudicar a estrutura dos linfonodos. Perda da integridade estrutural de linfonodo irá comprometer o experimento. Se necessário, remover a gordura da superfície linfonodo com finas pinças de dissecação (# 5 Dumont) sob um microscópio de dissecação. Linfonodos não deveria ter qualquer gordura restante na superfície do nó, pois isso irá obscura de imagem por espalhamento da luz.

Excisão adequada de linfonodos também é uma técnica importante para a prática antes da primeira experiência real.

3. Nod linfáticose de imagem de instalação e Considerações

Linfonodo deve ser assegurada para a fase de imagem, que neste caso consiste em uma câmara embutida. Aquecido, de oxigênio perfundidos mídia é bombeado para a câmara de um lado através de uma bomba peristáltica e aquecedor de inline, e ele sai através de um canal de queda-graduada em uma câmara de coleta com um tubo de vácuo para um balão de recolha de resíduos. No nosso sistema, o linfonodo está submerso em 37 ° C media e super-perfundidos com classe médica carbogênio (5% CO _2, 95% O _2). A temperatura do meio de perfusão deve ser registrada como perto do nó de linfa como é possível. Seu sistema em particular pode exigir variações na taxa de fluxo de mídia e cenografia para acomodar o estágio do microscópio e objetiva.

a. Linfáticos configuração de imagem nó:

Conforme mostrado no vídeo, que segura o linfonodo pelo primeiro anexá-lo, medular voltada para baixo (para a imagem de T ou células B zonas usando um microscópio vertical) para uma lamela de plástico, cortado no tamanho apropriado. É importante usar uma cola de tecido não-tóxico (usamos VetBond ™ da 3M Corporation).

A lamela é garantido na mídia que flui, colocando uma pequena bagatela de graxa de silicone na parte de baixo da lamínula, em seguida, aderir à essa base de vidro da câmara de imagem.

b. 2-Photon considerações de imagem:

Vários fatores podem causar linfócitos parar de se mover: temperatura muito alta ou muito baixa; potência do laser em excesso; compressão ou outros danos ao nó de linfa, e falta de oxigênio. Danos devido a potência do laser excessiva ou temperaturas> ~ 39 ° C é irreversível.

Se as células são fracas, é tipicamente melhor para aumentar o ganho de detector ou o protocolo de células-rotulagem em vez de usar um poder maior de laser para visualizar as células. Otimização de rotulagem ou expressão de proteínas fluorescentes pode ser necessária para trazer a fluorescência acima do nível de autofluorescência de fundo. Com ganho razoável e configurações de energia do laser, uma mudança dois log de fluorescência acima dos valores basais (medido por citometria de fluxo) é razoável para a visualização de células.

Sintonizável com dois fótons lasers, o comprimento de onda usado para a excitação deve ser um pouco inferior ao dobro do máximo de excitação o fóton único do fluoróforo sendo fotografada. Em dois fótons experimentos usando mais de um rótulo ou proteína fluorescente pode ser necessário fazer experiências com o comprimento de onda de excitação usada para encontrar os melhores ajustes para ambos os rótulos. Excitação de dois fótons também pode ser usado para estruturas de colágeno endógeno imagem, aproveitando o intrínseco de segunda geração azul harmônica. Geração de segundo harmônico (SHG) ocorre quando dois fótons são combinados dentro de um material e emitir um único fóton de duas vezes a freqüência dos fótons original. Em tecido, de dois fótons de excitação ocorre quando a luz do laser incidente é perpendicular a uma estrutura de proteínas altamente ordenada como o colágeno.

Questões práticas a respeito de dois fótons de imagem foram discutidas nas revisões preview ^{4, 5.}

Discussion

Neste protocolo de vídeo que mostram os procedimentos para a transferência de células adotivos e isolamento de linfonodo e preparativos necessários para a imagem da motilidade de linfócitos em um linfonodo periférico. Dois fótons de imagem tem várias vantagens sobre imagem confocal em ambos os tecidos explantado (mostrado aqui) e em preparações intravital. Notavelmente, a utilização de infra-vermelho de excitação minimiza espalhamento de luz e permite uma imagem a 300 micrômetros abaixo da cápsula do linfonodo e mais profundo em cerca de ⁴ tecidos. Além disso, multi-fotão excitação é restrito ao ponto focal da objetiva, minimizando foto branqueamento e dano tecidual lado de fora do plano focal. Como acontece com qualquer nova técnica, no entanto, dois fótons de imagem não é uma panacéia e suas limitações e perigos potenciais devem ser mantidos em mente ^5. Entre elas está a exigência de que - excetuando sinais intrínsecos, como geração de segundo harmônico por colágeno, células de interesse devem ser rotulados por sondas fluorescentes extrínseco ou pela expressão de proteínas fluorescentes. A impressão é assim criado que estas células marcadas estão nadando em um vazio negro e que na verdade eles estão imersos em e interagir com um ambiente complexo de elementos estruturais e uma miríade de outros sem rótulo, as células invisíveis.

Nos seis anos desde a introdução de dois fótons de imagem para imunologia, esta técnica tem permitido aos pesquisadores endereço de longa data perguntas a visualização direta em tecidos vivos intactos, incluindo processos de interações célula-célula, motilidade celular e localização, vias de sinalização celular e de células citotóxicas matando eventos. O campo tem evoluído rapidamente para além inicial descrições fenomenológicas, e análises quantitativas em conjunto com modelagem e simulação computacional estão começando agora a fazer sentido como os movimentos aparentemente caótica celular e interações dentro dos gânglios linfáticos levar a uma resposta imune eficiente. Este progresso é totalmente revisto em uma publicação recente ^1, que lista mais de 100 artigos descrevendo a aplicação de dois fótons de microscopia para immunoimaging.