Farelerde Periferik lenf nodu diseksiyonu ve 2-Foton Görüntüleme

Summary

İki foton görüntüleme ve bir bağışıklık yanıtı ¹ sırasında bazal koşullar altında lenf nodu içinde lenfosit motilite ve hücresel etkileşimleri ortaya çıkardı. Burada, T hücreleri, lenf düğümleri izolasyon ve görüntüleme motilite CD4 + T hücreleri eksplante lenf nodu evlatlık transferi göstermektedir.

Abstract

İki foton görüntüleme bazal koşullar altında lenf nodu içinde ve bir immün yanıt ¹ başlangıcında zarif bir koreografi motilite ve hücresel etkileşimleri ortaya çıkarmıştır. Burada, etiketli T hücreleri, lenf düğümleri izolasyonu, görüntüleme motilite ve CD4 + T hücreleri ilk kez 2002 ² açıklandığı gibi eksplante lenf nodu evlatlık transferi için yöntemler sunar. Bağışıklık hücrelerinin iki foton görüntüleme hücrelerinin bir hücre izci boya ile boyanarak floresan veya floresan proteini ifade ederek, ya etiketli olduğunu gerektirir. Biz bir alıcı hayvanın kuyruk ven, yaklaşık 15-30 dakika içinde lenfoid organlara evlerine içine donör farelerden elde edilen hücreler enjekte evlat edinen transfer prosedürü göstermektedir. Biz bir lenf nodu izolasyonu göstermek ve lenf düğümü eksize uygun montaj sağlamak için yöntemler tarif. Perfüze medya, sıcaklık ve lazer güç uygun oksijenasyon gibi diğer hususlar ele alınmıştır. Son olarak, naif CD4 3D video görüntüleri + T hücreleri mevcut 37 kararlı durum motilite sergileyen ° C

Protocol

1. Hücre evlatlık transferi:

Kuyruk ven veya göziçi enjeksiyon uygun hücre izci etiketli ya da floresan protein ifade lenfositler tanıtımı için iki yöntem vardır. Bu videoda. biz kuyruk damar enjeksiyonu hücreleri evlatlık transfer göstermektedir.

a. Malzemeler

CD4 + T hücreleri 37 º C'de 30 dakika süreyle 1.4 mcM KAKE ile etiketlenir, iki kez yıkanmış ve RPMI-1640 100 mcL yeniden askıya. Hücreler enjeksiyon için steril 28 gauge insülin enjektörü içine yüklenir. Kullanılan hücre sayısı deney yapılmaktadır bağlıdır. Tipik olarak, 5 milyon T hücreleri basit T hücre görünüm için yeterli değildir. Fare için bir kemirgen süzgeç, hayvan ve kendinize yaralanmayı önlemek için gereklidir.

b. Hayvan güvenliğini sağlama

Yavaş yavaş içine hayvan kemirgen süzgeç (video) destek ve pistonu hafifçe basılarak tüpün açık sonu kapanış fare tarafından evlat edinen transferi için güvence altına alınmıştır. Bu işlem sırasında bazı küçük hayvanlar süzgeç içinde dönüp gibi, fare kuyruğu gitmesine izin vermeyin. Bu yöntem, kendisi yaralandı ve enjeksiyon sırasında hareket hayvan önler. Kemirgen süzgeç kurarken, ileri atlama hayvan tutmak için gerekli daha ileri piston itmeyin. Ayrıca, uzun bir süre için süzgeç hayvan bırakmayın hayvana karşı piston itmeyin ve.

c. Kuyruk ven görselleştirme

Kuyruk parmağı üzerinden hafifçe sarılır ve baş parmağınızı parmak iç karşı düzenlenen böylece size doğru yavaşça çekin. Dik kuyruk iki tarafında bulunan kuyruk damarlar belirleyin. Görselleştirme sonra etanol ile silerek, ılık su ile kuyruk ısınmanın kolaylaştırılır.

d. Hücre enjeksiyonu

Ven yer olmuştur, sığ bir açı paralel damar şırınga konik tarafı yerleştirin. Ven, pistonu hafifçe bastırın; damar iseniz enjeksiyon NO direnç olmalıdır. HERHANGİ bir direniş var ise, şırınga kaldırmak ve farklı bir konuma içinde yeniden deneyin.

Ven iseniz enjeksiyon tamamlanıncaya kadar, pistonu yavaşça bastırın. Enjeksiyon sırasında kuyruk şişmiş haline gelmemelidir. Eğer, bu iğne ven değildir anlamına gelir. Enjeksiyon sırasında damar "kaybetmek" için mümkündür. Bu durumda, iğne kaldırmak ve farklı bir noktaya enjeksiyon deneyin. Eğer birden fazla enjeksiyon denemesi gerekiyorsa, orijinal enjeksiyon yerinde farenin vücut doğru kuyruk yukarı taşımak için en iyisidir. Evlatlık transferi başka bir girişim için kendinizi odaya vermek için kuyruk distalde başlayarak bu olasılığı önceden planlayın.

e. Post-enjeksiyon konuları

Enjeksiyonu tamamlandıktan sonra, ven kan küçük bir geri akış meydana gelecektir. Kanama durana kadar temiz bir silme ile enjeksiyon yerinde hafifçe basın. Plenseri ve kuyruk üzerine hafifçe tutarak hayvan, süzgeç, ileri doğru yürümeye.

Daima, hayvan bakımı komitesi ve hayvan kullanımını protokolleri ile uyum içinde olmasını sağlamak için kontrol edin. Gerçek deney denemeden önce bu tekniği birkaç kez uygulama için önemlidir.

2. Lenf Düğümü İzolasyon

Iki foton görüntüleme için lenf nodu İzolasyonu dikkatli çevreleyen doku doğru lenf nodu çıkarılması gerektirir.

a. Seçme ve periferik lenf nodu yeri

Görüntüleme için lenf nodu Seçim deneysel hedeflerine bağlı olacaktır. Lokal enfeksiyon veya enjeksiyon drenaj lenf düğümleri farkında olun ve görüntüleme için uygun bir düğüm noktası seçin. Van den Broeck ve ark makale, detay ³ fare lenf nodu yeri ve morfolojisi açıklamaktadır. Bu video, hücre izolasyonu veya görüntüleme için uygun olan altı büyük periferik lenf nodu eksizyonu göstermektedir.

b. Lenf nodu çıkarılması:

Lenf düğümleri çıkarırken doku bütünlüğü göz önünde tutun. Rüptürü kapsül veya herhangi bir şekilde zarar lenf nodu yapısını değil dikkatli olun. Lenf nodu yapısal bütünlüğünü kaybı deneyi tehlikeye sokacaktır. Gerekirse, bir diseksiyon mikroskop altında ince diseksiyon (# 5 Dumont) forseps ile lenf nodu yüzeyindeki yağ çıkarın. Lenf düğümleri bu ışık saçılması görüntüleme belirsiz gibi, düğümün yüzeyinde kalan tüm yağ olmamalıdır.

Uygun eksizyon lenf düğümleri de ilk gerçek deneyden önce uygulamaya önemli bir tekniktir.

3. Lenf Node Görüntüleme Kurulum ve Düşünceler

Lenf nodu, bu durumda gömme odasının oluşan görüntüleme aşamasına kadar güvence altına alınmalıdır. Sıcaklaşır, oksijen-perfüze medya, peristaltik bir pompa ve inline ısıtıcı kullanılarak bir taraftan odasına pompalanır ve bir atık toplama şişesi bir vakum tüpü ile toplama odasına aşağı doğru kademeli bir kanal üzerinden çıkar. Sisteminde, lenf nodu, 37 batmış ° C medya ve medikal carbogen (% 5 _CO 2,% 95 _O 2) ile süper-perfüze . Perfüzyon medya sıcaklığı mümkün olduğu gibi, lenf nodu yakın olarak kayıt altına alınmalıdır. Belirli bir sistemi, medya akış hızı ve sahne tasarımı farklılıklar mikroskop sahne ve objektif karşılamak gerekebilir.

a. Lenf nodu görüntüleme ayarları:

Videoda görüldüğü gibi, biz ilk ekleyerek lenf nodu güvenli, uygun boyutta kesilmiş bir plastik lamel, aşağı medüller tarafı (image T veya B hücre bölgeleri dik bir mikroskop kullanılarak). Non-toksik bir doku yapıştırıcısı (3M Corporation'ın VetBond ™) kullanmak önemlidir.

Lamel sonra görüntüleme odasının cam tabanı bu kalarak, alt kapak kayma küçük bir silikon gres dab koyarak akan medya güvence altına alınmıştır.

b. 2-Foton görüntüleme hususlar:

Lenfositler hareketli durdurmak için çeşitli faktörler neden olabilir: çok yüksek veya çok düşük sıcaklık, aşırı lazer güç, sıkıştırma veya lenf nodu diğer hasar ve oksijen eksikliği. Aşırı lazer güç veya sıcaklıklara bağlı hasar> ~ 39 ° C geri döndürülemez.

Hücreler loş, dedektör kazanç ya da hücre-etiketleme protokolü yerine hücreleri görselleştirmek için daha yüksek bir lazer güç kullanarak daha artırmak için genellikle daha iyidir. Floresan proteinlerle etiketleme veya ifade optimizasyonu arka plan otofloresans seviyesinden floresan getirmek için gerekli olabilir. (Flow sitometri ile ölçülen) taban çizgisinin üstünde floresan bir iki günlük bir kayma konusunda makul bir kazanç ve lazer güç ayarları, hücre görünüm için makul.

Uyarım için kullanılan dalga boyu ayarlanabilir iki foton lazerler ile görüntülü fluorofor çift tek foton uyarma maksimum biraz daha az olmalıdır. Birden fazla etiket veya floresan proteini kullanarak iki foton deneylerde, hem de etiketler için en iyi ayarları bulmak için kullanılan dalgaboyu deney için gerekli olabilir. İki foton uyarma aynı zamanda içsel mavi ikinci harmonik üretimi yararlanarak görüntü endojen kollajen yapılar için kullanılabilir. Ikinci harmonik üretimi (SHG) iki foton bir malzeme içinde kombine olduğu durumlarda meydana gelir ve orijinal fotonların iki kez frekans tek bir foton yayarlar. Doku, iki foton uyarma olay lazer ışığı gibi kollajen gibi bir çok sipariş edilen protein yapısında dik olduğu zaman oluşur.

Önizleme yorum ^{4, 5} iki foton görüntüleme ile ilgili pratik konular tartışıldı .

Discussion

Bu video protokol evlatlık hücre transferi ve periferik lenf nodu görüntüleme lenfosit motilite için gerekli lenf nodu yalıtım ve hazırlık işlemleri göstermektedir. İki foton görüntüleme hem eksplante dokular (burada görüldüğü gibi) ve intravital hazırlıklarında konfokal görüntüleme üzerinde birçok avantajı vardır. Özellikle, infra-kırmızı uyarma ışık dağılımını en aza indiren ve lenf nodu kapsül altında görüntüleme ~ 300 mikrometre sağlar ve bazı dokularda ⁴ derin kullanın. Ayrıca, çoklu foton uyarma beyazlatma fotoğraf ve odak düzlemi yan dışarı doku hasarı en aza indirmek amacı odak noktasına sınırlıdır. Ancak, herhangi bir yeni bir teknik olduğu gibi, iki-foton görüntüleme, her derde deva değildir ve kendi sınırları ve potansiyel ^tuzaklar, akılda 5 tutulmalıdır. Bunlardan ilgi kollajen-hücreleri tarafından ikinci harmonik oluşumu gibi içsel sinyalleri dışında floresan ekstrensek probları veya floresan proteinlerle ifade etiketli olmalıdır gerekliliğidir. Izlenim bu etiketli hücreleri böylece siyah bir boşluk yüzme oluşturulur; gerçeği dalmış, ve yapı elemanları ve sayısız diğer etiketsiz, görünmez hücreleri karmaşık bir çevre ile etkileşim oysa.

Immünoloji iki foton görüntüleme sunulmasından bu yana altı yıl içinde, bu tekniğin, uzun süredir bozulmadan yaşayan dokuların süreç, hücre-hücre etkileşimleri, hücre hareketi ve lokalizasyonu, hücresel sinyal yollar ve sitotoksik hücre de dahil olmak üzere doğrudan görselleştirme soruları yanıtlamak için araştırmacılar izin verdi olaylar öldürüyor. Alanında ilk fenomenolojik açıklamaları ötesinde hızla evrim geçirdi ve bilgisayar modelleme ve simülasyon ile birlikte kantitatif analizleri, lenf düğümleri içinde görünüşte kaotik hücresel hareketler ve etkileşimleri etkin bir immün yanıt yol nasıl mantıklı başlıyor. Bu ilerleme immunoimaging iki foton mikroskopi uygulama açıklayan 100 kağıtları listeleyen yeni bir yayın ^1, kapsamlı bir gözden geçirilir.