Summary
Biz bir decellularized akciğer ekstraselüler matriks ve fonksiyonel akciğer dokusu oluşturmak için kullanılan olabilir romanı biomimetic biyoreaktör geliştirdik. Biyoreaktör matris ve kültür hücreleri ekim, kısa bir süre için in vivo olarak nakledilen zaman etkili gaz değişimi gösteren doku oluşturur.
Abstract
Akciğer dokusu, akciğer kanseri ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı gibi kronik akciğer hastalıkları, yılda yaklaşık 280.000 ölüm kümülatif hesabı da dahil olmak üzere, kronik obstrüktif akciğer hastalığı, şu anda Amerika Birleşik Devletleri 1 dördüncü ölüm önde gelen nedenidir. Bu ölüm katkıda bulunmak, akciğerler genellikle tamir veya mikroskobik, hücresel düzeyde ötesinde yeniden bu bir gerçektir. Bu nedenle, akciğer dokusunda dejenerasyon ya da enfeksiyon veya cerrahi olarak rezeke edilen akciğer dokusunda hasara işlevsel in vivo olarak değiştirilir. Akciğer dokusunda in vitro oluşturulan olup olmadığını keşfetmek için, biz acellular akciğer ekstrasellüler matriks iskele üretmek üzere hücresel bileşenleri kaldırır bir prosedür kullanılarak yetişkin sıçanların akciğerleri tedavi. Bu iskele, hava yolları ve damarsal hiyerarşik dallanma yapıları, yanı sıra büyük ölçüde sağlam bodrum membran, kollajen IV, laminin ve fibronektin oluşan bir tutar. Iskele gibi negatif basınçlı ventilasyon ve pulsatil vasküler perfüzyon akciğer fizyolojisi eleştirel yönlerini taklit etmek için tasarlanmış bir biyoreaktör monte edilir. Kültür pulmoner epitel ve biyoreaktör monte iskele içinde vasküler endotel, biz yerel akciğer dokusunda fenotipik karşılaştırılabilir ve bu kısa zaman aralıklarında (45-120 dakika) için gaz değişimi katılmak mümkün akciğer dokusu oluşturmak mümkün. Bu sonuçlar cesaret ve akciğer matris bu repopulation akciğer rejenerasyonu için uygun bir strateji olduğunu düşündürmektedir. Bu olasılık, sadece nakli için akciğer dokusunun arzının artırılması yönünde çalışmak için değil, aynı zamanda daha uzun süreler için ve daha önce mümkün olduğundan daha daha doğru bir mikro-çevre içindeki solunum in vitro hücre ve moleküler biyoloji okumak için bir fırsat sunuyor.
Protocol
1. Biyoreaktör Meclisi
Ayrıntılı biyoreaktör tasarım ve montaj decellularization ve kültür için rakam (lar), sırasıyla Şekil 1 ve 2'de verilmektedir. Tüm bileşenleri biyoreaktör montajı önce sterilize edilmelidir. Aşağıdaki hususlara dikkat edilir:
BAĞLANTILARI:
- Arteryel kanül tüp kısa bir segment bir Y-splitter bağlı bir Luer-lock uydurma oluşur. Luer-lock konnektör perfüzyon tüp takılı ve pulmoner arter sütüre değildir Y segment bir tek yönlü valf bağlı. Tek yönlü valf, sıvı (ters yönde perfüzyon olarak) boru içine çekilebilir odaklı, ancak organ perfüzyon sırasında bütün orta akciğer akar.
- Trakeal kanül, boru ile Y-splitter bağlantılı bir Luer-lock konnektör oluşur. Luer-lock, trakea rezervuar ve ana oda arasında bir nefes döngü bağlanır. Trakea sütüre Y-konnektör bölümü de tek yönlü bir valf bağlanmaktadır. Tek yönlü valf arteryel kanül olarak aynı şekilde aydınlatmaktadır.
FONKSİYONLARI:
- Arteriyel ve trakeal kanül tek yönlü valfler, tüp ters akış sağlayan ve bu nedenle hava boşlukları giderilmelidir izin tüpün içinde hava kabarcıkları temizlemek için kullanılmaktadır.
- "Nefes döngü" gibi orta akciğer içine ve dışına farklı bir yol izler yerleştirilmiş iki adet tek yönlü valfler, içerir. Bu özelliğin daha ayrıntılı bir açıklama laboratuvar 2 yayınlanmadan önce sağlanmaktadır.
- Vasküler perfüzyon bir roller pompa kullanılarak sağlanır. Orta bağlı kanül aracılığı ile pulmoner arter içine perfüze, akciğer vasküler ve orta perfüzyon için hazırlanan ana biyoreaktör, doğrudan pulmoner ven dışarı akar.
2. Organ Harvest
- Amerikan Veteriner Hekimleri Birliği (60 mg / kg IP) tarafından belirlenen kurallarına göre, yetişkin (3-6 aylık) Fischer 344 sodyum pentobarbital aşırı dozda sıçanlarda Euthanize. Not: pentobarbital çözüm antikoagülasyon için 100 ünite / ml heparin içerir.
- Sprey veya% 70 etanol ile göğüs ve karın silin.
- Kalp ve akciğerler açığa akciğerlere zarar vermemeye özen, göğüs boşluğu açın. Akciğerlerde geri çekmek için neden, göğüs boşluğuna dikkatlice diyafram üzerinden küçük bir pencere yapmak, ve ardından akciğer temelleri açığa çıkarmak için yatay kesi genişletmek. Dikey kaburga üzerinden iki insizyon olun ve göğüs kafesi, kalp ve akciğerler maruz için geri çekmek.
- Yani, gravite perfüzyon sistemi kaldırıldı piston ile bir şırınga, bir 3-yollu stopcock ve 1.5inch, 21-gauge iğne ile boru ~ 20cm kullanarak hazırlayın. ~ 20 cm yukarıda bir halka standı kullanarak hayvan şırınga koruyun. Tüm hava perfüzyon tüp çıkarılır emin olun.
- Akciğerlere dönmesini engelleyerek, kan akıtmak için sağ atrium kesin. Akciğerlere kan ve perfüzat kolay drenaj izin vermek için sol atrium Kesme da yararlı olabilir, ancak gerekli değildir.
- Iğne sağ ventrikül tabanına yerleştirin ve PBS içinde heparin ve sodyum nitroprussid (50U/ml ve 1ug/ml, sırasıyla) bir çözüm ile akciğerlere serpmek için stopcock açık. Onaylayın, pulmoner arter perfüzyon sıvı ile doldurur ve bu kan akciğerlerden temizleyerek. Gerekirse, dolum ek sıvı ile perfüzyon şırınga. Genelde sadece ~ 10ml gereklidir.
- Devam perfüzyon akciğerlere kan açıktır kadar, daha sonra perfüzyon durdurun.
- Mümkün olduğunca boynuna, trakea ücretsiz teşrih. Emin olun trakea, yemek borusu ayrılır. Kalp, akciğer ve trakea kalan tüm bağlantıları teşrih ve en blok kaldırmak.
- Bir neşter ya da keskin bir makas kullanarak, sağ ve sol ventriküller açığa kalbin apeks kesti.
- Sağ ventrikül ve sütür ile pulmoner gövde Cannulate. Herhangi bir aşırı sol ventrikül doku çıkarın.
- Trakea ve sütür Cannulate. Hem trakeal ve pulmoner arter kanüller trakea, akciğerler, ya da büyük damarların (Şekil 1) üzerinde herhangi bir burulma gerilmesi olduğu gibi iyi konumlanmış olduğundan emin olun.
- Organ aracılığıyla sabit akış sistemi hava kabarcığı önleyebilir, arteryel kanül hiçbir hava kabarcığı olmadığından emin olun. Bazı durumlarda, bir hava kabarcığı tamamen sıvı flow.To gerçekleştirmek durdurmak, kalp / akciğer bloğun PBS içeren bir kavanoza koyun. Kabarcıkları dışarı atmak için küçük bir miktar PBS kalp kanül içine enjekte etmek için iğne ile bir şırınga kullanın.
- Akciğer mümkün olduğunca çok havayı çıkarmak için, PBS 4-5 kere solunum yolları Lavaj.
- Lavaj adım sonras tam 1ug/ml PBS içeren sodyum nitroprussid (SNP) ile akciğer şişirmek. Trakeal kanül bir stoper koyun, çözüm akciğer kalır. Aynı çözüm pulmoner arter yoluyla damar akar gibi akciğer vazodilatasyon izin, 30 dakika inkübe için izin verin.
- Y-şekilli kanüller, yukarıdaki "Biyoreaktör Meclisi" açıklanan bağlı Luer-lock bağlantıları kullanarak biyoreaktör kap kalp / akciğer bağlayın. (Şekil 1).
3. Organ Decellularization
- Decellularization aparatı kap (akciğerler bağlı) (Şekil 1) bağlayın. Pulmoner arter kanülü perfüzyon hattına bağlanması gerekir ve trakeal kanül halka açık olmalıdır. Tüm satırları, hava açık olduğundan emin olun. Yukarıda açıklandığı gibi, hava hatları decllularization sıvı akışını engelleyerek kötü decellularization bir kaynak olabilir. Sistemi içinde sıkışan havayı, aynı zamanda, hücre sağkalım 3 üzerinde olumsuz bir etkiye sahip olabileceği durumlarda, kültür zaman devam edebilir.
- PBS / SNP ile akciğer akciğerlerin aşırı şişirilmiş dolu, ancak kadar şişirin. Trakeal kanül hemen akciğer şişirilmiş kalacak şekilde kap.
- ~ 15 mmHg (20cm H 2 O basınç) en az 15 dakika süreyle PBS / SNP ile akciğer serpmek. 15 dakika veya daha uzun süre sonra, akciğer deflate izin trakeal kanül stoper çıkarın.
- 30 dakika PBS / SNP ile perfüzyon devam edin. Gerekirse, dolum PBS / SNP perfüzyon basıncı 10-15 mmHg korunmasını sağlamak için.
- Perfüzyon decellularization solüsyonu (8mm ahbap, 1M NaCl, 1X PBS içinde 25mm EDTA) ile başlayın. Tüm satırları, hava açık olduğundan emin olmak için özen gösterin. Bir vakum sistemi, emiş sağlamak için yararlı olabilir.
Kadar çözüm 500ml akciğer yoluyla perfüze decellularization çözüm serpmek. Optimal basıncı <15 mmHg (~ 20 cm H 2 O). Bu genellikle 2,5 saat gerekecektir. Akış hızları, başlangıçta genellikle çok yavaş (0.2-0.5ml/minute), ve hızlı bir şekilde ikinci saat boyunca yaklaşık 1ml/minute veya daha fazla artması. Periyodik olarak, yeterli sıvı sağlanması, biyoreaktör kullanılan decellularization sıvı kaldırmak, akciğer ve trakeal kanül destek beklemektedir.
4. Organ durulama ve sterilizasyon
- Akciğer ve doku kültürü kaputu biyoreaktör aktarın. Decellularization sıvı içeren 500ml kavanoz kaldırma ve 1L kadar steril PBS içeren steril bir kavanoz ile değiştirerek steril PBS ile durulama başlayın. Vakum emiş hatları hava açık olduğundan emin olmak için kullanın.
- 10-15 mmHg damar yoluyla serpmek PBS, decellularization için de aynı şekilde. Periyodik olarak, biyoreaktör atık PBS kaldırmak ve temiz, steril PBS ile PBS kavanoz yerine ve / veya dolum. Steril tekniğinin kullanılması tavsiye edilir.
- En az 2,5 L steril PBS akciğer perfüze kadar Yıkamaya devam edin.
- Taze PBS içeren bir yeni, steril bir biyoreaktör sistemi akciğer aktarın. Tüm perfüzyon loop ve tüm hava yolu hatları sıvı ile dolu olduğundan emin olun. Tüm sonraki adımları 5ml/min akciğerler serpmek için pulsatil pompa kullanabilirsiniz.
- PBS içinde% 0.1 perasetik asit ile PBS +% 10 FBS +% 10 kalem strep çözüm ya da bir gecede 3 saat perfüzyon yoluyla, iskele sterilize edin. Ikincisi artık asit kaldırmak için, birkaç saat içinde 250 ml PBS 3 değişiklikleri ile akciğer durulama gerektirir. Her durulama için, akciğer dokusunun tüm parçaları iyice durulanır olduğundan emin olmak için hem de perfüze havalandırmalı olmalıdır.
- Sıcaklığı Benzonase tedavi için hazırlık dengelenmiş kadar% 10 FBS ve% 10 penisilin / ~ 1hr streptomisin veya PBS ile 37 ° C inkübatör ve serpmek için akciğer aktarın.
- Kalıntı DNA kaldırmak Benzonase akciğer davranın:
- 37 ° C'ye kadar Benzonase tampon Sıcak (Reaktifler Tablo bakınız)
- Her bir akciğer için tampon 90U/ml Benzonase Benzonase sadece tampon ve bir 10 ml şırınga ile bir 10ml şırınga doldurun.
- Akciğer perfüzyon durdurun.
- Benzonase tamponu ile havayolu şişirin.
- Akciğer deflate izin ver (yaklaşık 1 dakika boyunca). Sonra, akciğer Benzonase çözümü ile şişirmek. Benzonase tampon ve Benzonase enflasyon sırasında, herhangi bir hava akciğer içine enjekte önlemek için deneyin.
- Akciğer Benzonase ile şişirme sonra 1 saat süreyle 37 ° C'de perfüzyon veya havalandırma olmadan oturmak için izin verin.
- PBS +% 10 FBS, biyoreaktör zaten% 10 penisilin / streptomisin ve gece boyunca devam perfüzyon Özgeçmiş. Ertesi gün, akciğer ya 4 saklanabilir ° C (3 ay) veya hücre tohumlama için hazırlanmıştır.
- Hücresel repopulation iskele hazırlamak için, PBS / FBS / kültür ortamı ~ 250ml Benzonase çözüm değiştirin. Hücreleri tanıtıldı önce en az bir saat için serpmek,nd doğrudan ekim hücreleri önce taze kültür ortamı değiştirin.
5. Recellularization
Organ yeniden tohumlama için hücre kaynağının seçimi, bireysel araştırmacılara bırakılmıştır. Piyasada bulunan nüfus, taze izole yenidoğan veya fetal akciğer hücreleri, embriyonik kök hücreler, ya da piyasada bulunan hücre kaynakları da dahil olmak üzere, birçok hücre kaynakları kullanılabilir. Bu hücre popülasyonları için özel izolasyon protokolleri, başka bir yerde 4,5,6 bulunabilir . Burada, biz nasıl tohum hem endotel ve epitel hücre popülasyonlarının talimatlar sağlar.
Endotel tohumlama:
- Uygun bir kültür ortamı, arzu edilen endotel hücre nüfusun bir süspansiyon hazırlayın. Hücre kümeleri kaldırmak için bir 40um hücre süzgecinden süzülür hücre süspansiyonu. Laboratuvarımızda tipik bir endotel tohumlama kültür ortamı 60ml içinde yaklaşık 30 milyon sıçan akciğer mikrovasküler endotel hücreleri kullanmak istiyorsunuz.
- Hücre süspansiyonu geçici biyoreaktör (Şekil 2) perfüzyon döngüsü içine küçük bir rezervuar içine koyun. Bu rezervuar ve tüm perfüzyon döngüsü tüp hava kabarcıkları açık olduğundan emin olun.
- Bir silindir pompa kullanılarak 3ml/min pulmoner arter içine hücreleri infüze.
- Hücre infüzyonu sonra, istenilen hızda ana biyoreaktör sirküle orta perfüzyon devam etmektedir.
- Günlük olarak, perfüzyon tüp hava kabarcıkları açık olduğundan emin olun.
- Orta taze orta ile düzenli olarak değiştirilmesi gerektiğini, bu genellikle 3-4 günde yapılır.
Epitel tohumlama:
- Istenilen epitel hücre popülasyonunun bir hücre süspansiyonu hazırlayın. Laboratuvarımızda, bu genellikle yaklaşık 50-100 milyon yenidoğan sıçan akciğer hücreleri oluşur. 40um hücre süzgecinden nüfus Filtre ve bir şırınga kültür ortamı 15ml askıya. Kültür ortamı 80ml ile hava yolu rezervuar doldurun.
- 37 ° C doku kültürü inkübatör biyoreaktör yerleştirin ve havalandırma için şırınga pompası bağlamak. Tüm havalandırma hatları, hava açık olduğundan emin olun.
- Hücre süspansiyonu 15ml trakeal kanül içine tek bir bolus olarak enjekte edilerek akciğer Tohum hücreleri.
- Hemen şırınga pompası kullanan bir tek, yavaş nefes başlar. Bu nefes, bu nedenle yaklaşık 20 dakika süren 3ml/minute ana biyoreaktör hava 60ml çekilme tarafından yönetilmektedir. Ana biyoreaktör hava filtreleri hücre süspansiyonu enjekte hemen sonra ve yavaş nefes başlamadan önce kapatılmış olun.
- Akciğerler daha sonra yavaş vasküler perfüzyon başlamak (yaklaşık 0.5 ml / dak) yaklaşık 18hrs statik oturup, ve izin verin.
6. Organ Kültür
Perfüzyon ve havalandırma detayları, deneysel tasarım dayalı çeşitlilik göstermekle birlikte, aşağıdaki noktalara dikkat:
- Endotel kültür sırasında, perfüzyon genellikle 1-3 ml / dk bir roller pompa kullanılarak yapılır. Epitel kültürü sırasında, havalandırma genellikle sürekli bir hızda dakikada bir şırınga pompası ile 1 nefes verilir. Ana biyoreaktör hava 5-10ml Çekilmesi genellikle, normal bir gelgit hacmi akciğer ventilasyonu etkisi gereklidir. Ventilasyon sırasında biyoreaktör hava geçirmeyen korumak için ihtiyaç nedeniyle, havalandırma günlük duraklatılmış olmalıdır ve ana odasında hava değişimi yapılmalıdır. Sistemdeki tüm hava kısmi basıncı yaklaşık% 21 oksijen oda havası. Biyoreaktör (akciğer sıvı 5-10ml ilham indükler) hava 5-10ml çekilme akciğer boyutuna dayanır ve kaç loblar kültürlü (iken loblar, analiz için bağlanır. kalan loblar) kültür devam ediyor. Şırınga pompası tarafından çekilen hava miktarı tahmin kültürlü akciğer "gelgit hacmi" seçilir.
- Orta 3-4 gün boyunca her kültür yaklaşık değiştirilmesi gerekir.
- Epitel ve endotel, laboratuvar tipik ilk tohum mühendislik doku havalandırılan hangi süre içinde 4-8 gün, epitel deneyleri hem de co-kültür sırasında. Endotel sonra doku hem de perfüze ve havalandırmalı, bundan sonra, perfüzyon yoluyla numaralı seribaşı.
7. Temsilcisi Sonuçlar:
Decellularization
Protokolü doğru yapıldığında, taze çıkarılan akciğerlerin sızıntı hava tutmak gerekir. Pompalarında hava ile şişirme kontrol edebilirsiniz - hava kaçağı belirten varsa kabarcıkları olmamalıdır. (37 ° C ve PBS sonuçta akciğerler yoluyla yaklaşık 10 ml / dk akış gerekir - 3 saat sonraki decellularization 2.5 boyunca akciğerler yoluyla decellularization sıvı akışı ~ 500ml izin vermelidir~ altında durulama sonunda hidrostatik basınç 15 mm Hg). % 0.1 perasetik asit ve Benzonase ile tedaviden sonra, akciğerler 4 ° C 'de 3 ay kadar saklanabilir, ve hala recellularization için uygun kalır.
Son decellularized ekstraselüler matriks hücresel malzemeler tamamen yoksun olması ve yerli akciğer, brüt, mikroskopik ve ultrastrüktürel özellikleri korumak gerekir. Yetersiz decellularization veya durulama kalıntı DNA (karşılaştırma için bkz: Şekil 3), leke standart hematoksilen ve eosin ile görüntülendi olabilir iskele, "yapıştırma" neden olabilir.
Asellüler matriks ve akciğer doku kültürü, Repopulation
Hücreler taze Petersen ve arkadaşları 4 çalışma eşlik çevrimiçi ekte açıklanan 7 gün eski yenidoğan sıçan yavrular, izole edilir, birini (10 yavruların yavruların ortalama 120-150 milyon hücrelerinin bir hücre verim bekleyebiliriz biraz üzerinde 10 milyon yenidoğan başına hücre).
Biyoreaktör akciğer hücre ekim ve sonraki kültür için en uygun koşulları iyi dağıtılmış hücrelerin akciğer 5 loblar içinde verim ve ekstrasellüler matriks iskele (Şekil 3) yaklaşık% 70 kapsama sağlamak gerekir. Kültürlü hücre popülasyonunun göreceli bolluk sırasına göre pro-salgı protein-C (SPC), Clara hücre salgı protein (CCSP) ve aquaporin-5 (AQP), (Şekil 4) gibi önemli solunum hücre belirteçleri için pozitif olacaktır.
Şekil 1. Şırıngalar pozisyonları ve decellularization biyoreaktör
Şekil 2 Biyoreaktör tohumlama mühendislik akciğer dokusunun ve kültür için kullanılan
Şekil 3 yerli, decellularized Histoloji ve depolanmışsa akciğer
Şekil 4 önemli akciğer belirteçler için immünofloresan boyaması
Discussion
Sistemin en kritik yönlerini burada kısırlık bakım ve vasküler yatağın iskele ve kültür depolanmışsa akciğer hazırlanması ve ekim süreci boyunca uygulanan baskıların yakından izlenmesi sundu. Sterilite kullanmadan önce tüm malzemeleri otoklav ve kapalı bir sistem, kısa bir süre eksplant sonra akciğer montaj ve bu bariyer sonraki ihlalinden kaçınarak en iyi korunur. Decellularized matris iyice durulanır ve steril bir kültür biyoreaktör transfer sonra, silikon kapağı ve diğer mühürler ve bağlantıları rahatsız veya kaldırılabilir olmamalıdır. Mümkün basınçları kontrol altında tutmak için, yerçekimi tarafından tahrik akış tercih edilir. PBS ve devam eden kültür sırasında ile iyice durulandıktan sonra başlayan, bir pompa sıvı devridaim için gerekli olduğunda, doğrudan dalmadan hemen önce sıvı basınç dönüştürücü ile pulmoner arter basıncı ölçüm tavsiye ederiz. Uygulanan basıncın büyüklüğü 15 mm Hg geçmemelidir.
Recellularized akciğerler genellikle 4 günden 3 haftaya kadar değişen zaman dilimlerinde, değişik kültür olabilir. Havalandırma genellikle epitel kültürü sırasında 1 nefes / dakika hızında uygulandığında ise vasküler perfüzyon genellikle 1-3 ml / dk endotel kültür sırasında gerçekleştirilir. Kombine kültür dönemlerinde, simultane ventilasyon ve perfüzyon uygundur. Havalandırma sıvı orta veya hava ile yapılabilir.
Son birkaç on yıl boyunca, çeşitli gruplar, akciğer epitel ayırt in vitro ve fizibilite kopyalayan akciğer mikroanatomisinin 7,8,9, 10 çeşitli yönlerini gösteren önemli doku mühendisliği çalışmaları yaptık . Ancak, yakın zamana kadar, akciğer dokusunda mühendisi bu girişimleri 4,5 hiçbiri implante organ, kan ve hava yolu arasındaki mesafeyi korumak için ve gaz alışverişinde de katılabileceği bir yol açtı . Bu nedenle, açıklanan yöntemlerden sadece fonksiyonel akciğer dokusu üretme uzun vadeli bir hedefe doğru bir ilk adım olmasına rağmen, bu işi nakli için kullanılabilir akciğer dokusunun miktarını artırarak olasılığı yönünde cesaret verici bir adımdır. Ayrıca, doku mühendisliği karmaşık üç boyutlu yapılar için bir iskele olarak bu işi bir decellularized ekstrasellüler matriks etkinliğini gösteren ve çeşitli türde hücrelerin büyüme ve hayatta kalma destekleyen, Ott ve ark. Uygun ve arkadaşları 11,12 tarafından yapılan çalışma ayrıntılarına . Bu çalışma solunum hücre ve moleküler biyologlar armamentarium katkısı da önemlidir. Kültür kemirgen epitel, daha geleneksel yöntemleri 13 ile laboratuvar, bilim adamlarının ne zaman biriyle karşılaşabilirsiniz de uygun, mekanik uyaranlar sağlayabilir ve bu hızlı de-farklılaşma görevlisi tehlike paylaşmak değildir eşsiz, üç boyutlu bir ortam sağlayarak sistemi, hücre farklılaşması ve fonksiyon bir rol oynayan hücre-hücre ve hücre-matriks etkileşimleri yeni bir fikir edinmek için. Bu bilgi Cortiella grubu ilk çalışmalar 14 gösterdiği gibi, çeşitli kök hücre popülasyonlarının kaderi kılavuzu koz olarak kullanılması halinde, özellikle güçlü olabilir .
Disclosures
LEN Humacyte, rejeneratif tıp şirket hisse senedi tutar. Humacyte bu çalışmaların finanse etmedi, ve açıklanan deneyler veya yöntemlerden herhangi birinin tasarım, yorumlama ve raporlama etkilemez. Yazarlar (LEN, THP, EAC) ve Yale Üniversitesi, akciğerlerde doku mühendisliği ile ilgili bir patent başvurusunda var.
Acknowledgments
Biz Maegan B. Colehour biyoreaktör gelişimi ile yardım için teşekkür ederim. Bu çalışmalar Yale Üniversitesi Anestezi ve NIH hibe HL 098.220 (LEN) tarafından finanse edilmiştir. THP, Ulusal Sağlık Enstitüsü, T32 GM007171 tarafından desteklenen oldu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Euthanasia | |||
| Heparin | Sigma-Aldrich | H4784 | |
| Sodium nitroprusside | Fluka | 71778 | |
| Euthasol euthanasia solution | Virbac Animal Health | 710101 | 390 mg/ml pentobarbital sodium stock solution should be diluted appropriately for IP administration |
| Decell Solution | |||
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C3023 | |
| NaCl | American Bioanalytical | AB01915 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| NaOH | JT Baker | 3722-01 | |
| 1X PBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| Bioreactor Components | |||
| 480 ml jar | Cole-Parmer | EW-3460560 | |
| Silicone stopper, size 14 | Cole-Parmer | EW-06298-26 | |
| Y-connectors | Cole-Parmer | ED-30614-08 | Used for arterial and tracheal cannulae |
| Silicone tubing | Masterflex (Cole Palmer) | 96420-14; 16 | L/S 14; 16 |
| Pressure Transducers | Edwards Lifesciences | PX-212 | |
| Check valve | Cole-Parmer | EW-98553-20 | One-way valve |
| 4-way stopcocks | Edwards Lifesciences | 594WSC | |
| Syringe filter | Cole-Parmer | 2915-08 | PTFE, 0.2μm |
| Decell and rinsing apparati (additions to bioreactor) | |||
| 500 and 1000 ml glass bottles | Corning | 1395-500; -1L | Used for decell and rinsing by gravity |
| Benzonase Treatment | |||
| Penicillin/streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140122 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| Tris-HCl | American Bioanalytical | AB14043 | 1M, pH 8.0 |
| MgCl2 | JT Baker | 2444-01 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Endonuclease used to remove remnant DNA from matrix |
References
- American Lung Association. Lung Disease Data. , (2008).
- Petersen, T. H., Calle, E. A., Colehour, M. B., Niklason, L. E. Bioreactor for the Long Term Culture of Lung Tissue. Cell Transplant. , (2010).
- Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. Mechanisms of surface tension induced epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening. J Appl Physiol. 94, 770-783 (2003).
- Petersen, T. H. Tissue-Engineerined Lungs for in Vivo Implantation. Science. 329, 538-5341 (2010).
- Ott, H. C. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat Med. 16, 927-9233 (2010).
- Cortiella, J. Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation. Tissue Eng. Part A. 16, 2565-2580 (2010).
- Sugihara, H., Toda, S., Miyabara, S., Fujiuyama, C., Yonemitsu, N. Reconstruction of alveolus-like structure from alveolar type II epithelial cells in three-dimensional collagen gel matrix culture. Am J Pathol. 142, 783-7892 (1993).
- Choe, M. M., Sporn, P. H., Swartz, M. A. Extracellular matrix remodeling by dynamic strain in a three-dimensional tissue-engineered human airway wall model. American Journal Respiratory Cell Molecular Biology. 35, 306-306 (2006).
- Cortiella, J. Tissue-enginered lung: an in vivo and in vitro comparison of polyglycolic acid and pluronic F-127 hydrogel/somatic lung progenitor cell constructs to support tissue growth. Tissue Engineering. 12, 1213-1213 (2006).
- Price, A. P. Development of a Decellularized Lung Bioreactor System for Bioengineering the Lung: The Matrix Reloaded. Tissue Eng Part A. , (2010).
- Ott, H. C. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. 14, 213-221 (2008).
- Uygun, B. E. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. 16, 814-820 (2010).
- Shannon, J. M., Mason, R. J., Jennings, S. D. Functional differentiation of alveolar type II epithelial cells in vitro: effects of cell shape, cell-matrix interactions and cell-cell interactions. Biochim. Biophys. Acta. 931, 143-156 (1987).
- Cortiella, J. Influence of Acellular Natural Lung Matrix on Murine Embryonic Stem Cell Differentiation and Tissue Formation. Tissue Eng Part A. , (2010).
