Summary
نحن هنا وصف تقنية فعالة من حيث التكلفة للثقافة عضوي النمط الشبكية الخنزيري الكبار لمدة سبعة أيام. لفترة وجيزة ، تم استخدام ورقة فلتر العقيمة لرفع الشبكية العصبية الخروج من RPE ومكان الجانب مبصرة حتى على إدراج التي أثارها موقف مخصص الصنع.
Abstract
هناك طلب المعترف بها في النماذج المختبرية التي يمكن أن تحل محل أو تقليل التجارب على الحيوانات. الخنزيري الشبكية لديها بنية مماثلة لشبكية العين البشرية العصبية ، وبالتالي نوعا قيما لدراسة آليات إصابة شبكية العين البشرية والأمراض التنكسية. نحن هنا وصف تقنية فعالة من حيث التكلفة للثقافة عضوي النمط الشبكية الخنازير معزولة عن أعين الكبار الحصول عليها من مسلخ. بعد إزالة الجزء الأمامي ، استخدمت شفرة منقب لإنشاء عدة العصبية الشبكية ، بروك الأغشية المشيمية RPE - - explants الصلبة من الجزء الخلفي من العين الخنزيري الكبار. تم استخدام قطعة من ورق الترشيح العقيمة لرفع الشبكية العصبية الخروج من كل ازدراع. كان المثقف مرشح الورق الشبكية المعقدة (الجانب مبصرة متابعة) an فوق إدراج ، والتي عقدت بعيدا عن قاع الطبق الثقافة من خلال موقف مخصص الصنع. موقف يسمح للتداول جيدة من الثقافة المتوسطة لكلا الجانبين من شبكية العين. عموما ، هذا الإجراء هو بسيط ، واستنساخه ، وتصاريح الحفاظ على بنية شبكية الأصلي لسبعة أيام على الأقل ، مما يجعلها نموذجا مفيدا لمجموعة متنوعة من الدراسات المورفولوجية والدوائية والكيميائية الحيوية على شبكية الثدييات.
Protocol
1. اتخاذ موقف مخصص لصنع إدراج خلية ثقافة
قاعدة معلومات سرية ماصة 5 مل (ISC BioExpress ، # P - 3250 - 19) ويبلغ قطرها الداخلي 13 ملم ، والذي يطابق تماما حجم القاع (12.6 ملم ، وقطرها الخارجي) من 10 ملم (القطر الداخلي) الخلية نونك إدراج الثقافة (8 ميكرومتر ، البولي الغشاء ، الحرارية ، # 137443). لجعل الموقف ، تم قطع ماصة قرب قاعدة لانتاج 6 ملم اسطوانة جوفاء طويلة. ثم أزيلت قطعة من جانب اسطوانة باستخدام شفرة اللهب ساخنة لإنشاء 3 الساقين (4 مم في الارتفاع) ضمن حلقة (2 مم في الارتفاع) ، الأمر الذي أثار ارتفاع إدراج بحوالي 5 ملم.
2. إعداد ورقة لتصفية معقمة مرفق والثقافة الشبكية الخنازير
وقطعت ورقة تصفية Whatman 4M (القط رقم 1004) في شكل دائري (6.3 مليمتر في القطر) مع مقبض صغير الثلاثي الذي كان يستخدم لنقل ورقة الترشيح في أنبوب من الزجاج لتعقيم أو مرة واحدة وكان يعلق على شبكية العين (كما هو الحال يظهر في شريط الفيديو).
3. إعداد explants الشبكية
العيون في الفترة من 5 -- 9 إلى الشهر القديمة ، 150-230 رطلا ، وتم الحصول على الاميركي يوركشاير الخنازير من المسالخ المحلية في غضون ثلاث ساعات من استئصال (تنقل على الثلج). انخفضت لدى وصوله ، وتم تنظيف العينين من الأنسجة الغريبة ، في حل betadine (10 ٪ بوفيدون اليود ، وشركة فريدريك بوردو ، ستامفورد ، ط م) وغسلها مرتين في النسر Dulbecco ومتوسطة التعديل (DMEM مع 1G / L الجلوكوز ، L - الجلوتامين ، والبيروفات الصوديوم ، Cellgro - mediatech شركة ، ومنسى ، VA) تستكمل مع 2.5 ميكروغرام / مل باء الامفوتريسين (Gibco - Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا). تمت إزالة الجزء الأمامي ، وفضح الشبكية العصبية. وقد استخدمت ستة ملم شفرات منقب (ستورز البصريات ، وباوش ومب ، مانشستر ، MO) لخفض الاستوائية ، كامل الجزء الخلفي للسمك explants. وكان في وقت لاحق مقشر الشبكية من خلال تطبيق قبالة بلطف ورقة جافة معقمة على تصفية طبقة الخلايا العقدة ، ورفع قبالة الشبكية العصبية ، ووضع ورقة الترشيح مع شبكية العين تعلق على إدراج الثقافة ومبصرات مواجهة. ثم وضعت على إدراجها في مستنبت ، مع التأكد من تغطية كامل شبكية العين ، في صحن الثقافة 12 - جيدا (فيشر). تم الحصول على explants متعددة بشكل روتيني ومثقف من عين واحدة.
4. نسيج الثقافة
كان المثقف في الأنسجة الشبكية متوسطة النسر الأساسية الدنيا (MEM ، Invitrogen - Gibco لايف تكنولوجيز ، روكفيل ، دكتوراه في الطب) ، ودرجة الحموضة 7.4 ، على أن تستكمل مع 0.2 ملغ / مل الجلوتامين ، 10 الانسولين الخنزيري ميكروغرام / لتر ، 1 البيروفات مم ، 0.1 ملي L - حمض الأسكوربيك ، 100 U / مل البنسلين ، 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين ، و 250 نانوغرام / مل الأمفوتريسين B (مضاد حيوي مضاد فطري : سيغما ، وسانت لويس ، MO) ، والغازية مع مرطب 5 ٪ CO 2 ، والهواء التوازن ، في 37 درجة مئوية. وجرى تبادل المتوسطة كل يومين.
ويمكن استخدام النسيج ، وتعامل مع مجموعة متنوعة من الكواشف أو تحقيقات أو تركت دون علاج لاحقة أو التحليلات البيوكيميائية المورفولوجية. المقطع أدناه يصف الإجراءات لتهيئة كاملة سمك الشبكية متسقة المقاطع العرضية.
5. Sectioning
- باستخدام ناظم البرد
- إصلاح الأنسجة الشبكية في parafomaldehyde 4 ٪ بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية ؛
- شطف الأنسجة لفترة وجيزة مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ؛
- إزالة الأنسجة بعناية من ورقة الترشيح ، بينما هو في برنامج تلفزيوني في صحن 35 ملم باستخدام مجهر تشريح ؛
- نقل الأنسجة لالسكروز 30 ٪ بين عشية وضحاها والحفاظ على 4 درجات مئوية ؛
- شفط بعيدا الحل الزائدة حول الأنسجة ، وإضافة ما يكفي من الأنسجة تيك المتوسطة (مجمع أكتوبر 4583) لتغطية الأنسجة ، والسماح لها نقع في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة لتتغلغل في النسيج ؛
- بناء الإطار مربع (10 ملم × 10MM ، 5 ملم الإرتفاع) مع شمع طب الأسنان ، ووضعه في جميع أنحاء الأنسجة ؛ إضافة المزيد من الأنسجة تيك المتوسطة لملء الإطار (تأكد من أن عينات الأنسجة مسطح) ووضع في الثلاجة (-- 20 درجة مئوية) لمدة لا تقل عن 1 ساعة ؛
- نقل كتلة عينة مجمدة إلى منصة عينة (تأكد من كتلة العينة العمودي إلى منصة) ؛
- تركيب منصة العينة في السابق ناظم البرد المبردة (-20 درجة مئوية ، لايكا ، CM1900) وتأكد من أن كتلة رأسية للشفرة ؛
- إزالة الشمع وكتلة الإطار قبل sectioning النسيج في سمك المطلوب ؛
- مكان الأقسام على الجيلاتين معاملة الشرائح.
- باستخدام Vibratome
- الإصلاح وشطف النسيج على النحو المبين أعلاه لناظم البرد ؛
- مكان النسيج إلى ما قبل ساخنة آغار ذاب ، و 4 ٪ في وعاء صغير والحفاظ على 4 درجات مئوية حتى congeals آغار تماما ؛
- استخدام شفرة حادة لخفض آغار الى كتلة صغيرة مع عينات الأنسجة داخل ؛
- الغراء كتلة العينة على صاحب العينة vibratome مع الغراء Krazy (تأكد من أن قطعة من عينات الأنسجة رأسيا إلى المنصة من اله صاحب العينة ، أي بشكل عمودي على النصل) وجبل لحامل على نظام vibratome sectioning (لايكا ، السلسلة 1000) مع كتلة العينة مغمورة تماما في المياه الجليدية ؛
- خفض كتلة العينة إلى 50 ميكرومتر المقاطع ووضعها على الجيلاتين معاملة الشرائح بفرشاة ناعمة.
6. المناعية
استخدام أي بروتوكول قياسي. يمكن الاطلاع على أجزاء سميكة Immunolabeled مع المجهر مبائر.
7. ممثل النتائج :
كان الحفاظ على التشكل خلال فترة السبعة أيام من الثقافة. صور لشبكية العين قبل وبعد زراعة تتوفر في شريط الفيديو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد أنشأت الباحثين رؤية مجموعة متنوعة من النظم الشبكية الثقافة ، بما في ذلك نظم عضوي النمط ، لدراسة مجموعة متنوعة من القضايا ، مثل زرع الخلايا الجذعية في شبكية العين 1 ، 2 التجدد الشبكية ، والتعبير الجيني الخارجية 3-5. ومع ذلك ، شبكية الثدييات الكبار من الصعب المحافظة في المختبر ، ويرجع ذلك أساسا لمطالب الطاقة العالية من المستقبلات الضوئية 6. ووصف كويزومي وآخرون. أرنب الشبكية نظام الثقافة عضوي النمط الذي تم تحسينها في امدادات الاوكسجين للخلايا مستقبلة للضوء عن طريق رفع ذروة إدراج الثقافة وتهييج متوسطة الثقافة. أوضحوا بنجاح نسيج الشبكية البالغين لمدة تصل إلى ستة أيام 4،5. وصف Kobuch آخرون نظام الثقافة نضح لشبكية العين والشبكية الخنزيري الكبار الظهارة الصبغية (RPE) وكانوا قادرين على الحفاظ على نسيج عضوي النمط لا يقل عن 10 يوما 7. ومع ذلك ، كان معقدا الداخلي لإعداد ورقة الشبكية - RPE - المشيمية للتلاعب المختبرية والأدوات المطلوبة الخاصة. بالإضافة إلى ذلك ، يطلب من كل يزدرع نظامها نضح بها القرارات في الثقافة المختبر عينات الأنسجة المتعددة مرهقة. . Kaempf آخرون بنجاح إنشاء نموذج آخر عضوي النمط من الثقافة الشبكية العصبي الحسي الثدييات الكبار في الثقافة بالتعاون مع RPE لكن النتائج أظهرت فقط من أجل ثقافة لمدة 3 أيام ، وكان يتم اختبار بقاء طويل الأمد في الأنسجة 8.
في هذا المخطوط ، ونحن تصف بروتوكول بسيطة وقابلة للتكرار للثقافة عضوي النمط الشبكية الخنزيري الكبار العصبية اعتماد نهج مماثلة لتلك التي سبق وصفها لشبكية العين 4 الأرنب مع الميزات التالية :
- إنشاء تقنية بسيطة لاتخاذ موقف مخصص لجمع ذروة إدراج الثقافة ، وضمان امدادات الاوكسجين جيدة لازدراع شبكية العين كلها. باستخدام ماصة 5 مل تلميح لإنشاء موقف يؤكد التي يمكن تعقيمها على الوقوف والتي يمكن تعديلها في الارتفاع إذا رغبت في ذلك.
- ثقافة الشبكية مع طبقة مبصرة تواجه صعودا ، وذلك على عكس طبقة الخلايا العقدية. بهذه الطريقة ، قد زادت من مبصرات الوصول إلى الأوكسجين ، والتحريض على مواصلة تعزيز امدادات الاوكسجين ليست ضرورية.
- التقليل من الصدمات الميكانيكية. ويعلق explants الشبكية إلى ورقة تصفية معقمة قبل تقشير منهم من RPE ومن ثم يتم تربيتها على ورقة الترشيح ، وبالتالي تقليل الضغط الميكانيكي على الأنسجة ومنع الشباك في شبكية العين.
- التناسق في حجم explants الشبكية. لأن يستخدم لإنشاء منقب explants ، كل يزدرع الشبكية هي من نفس الحجم ، مما يجعل من السهل مقارنة نتائج العلاجات المختلفة.
- الحفاظ على شكلها. بنية شبكية العين الخنازير في ثقافة هذا النظام لا يزال سليما لسبعة أيام على الأقل.
بالنظر إلى أن الخنازير والشبكية الإنسان متشابهة جدا من حيث التوزيع ومورفولوجية الخلية ، ونمط الأوعية الدموية ، وسماكة طبقة ، والخصائص الفيزيولوجية الأخرى 9،10 ، والثقافة عضوي النمط الشبكية الخنزير حيوان نموذجا جذابا لدراسة مظاهر أمراض شبكية العين البشرية ، الإنحطاط ، والإصابات. قد يكون هذا النظام أهمية خاصة في الحالات التي يكون فيها في التجارب المختبرية على شبكية العين البشرية هي من المستحيل تنفيذ الواجب ، في جزء منه ، لعدم وجود ذات جودة عالية الأنسجة البشرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح EY 012031 (ET - A) ، على جائزة من مؤسسة كيربي FM (ET - A) والبحوث للوقاية من العمى ، وشركة (MAZ) ، وعين جديدة ليونز جيرسي مؤسسة أبحاث (MAZ) معهد عين ولاية نيو جيرسي (MAZ) ، وجيه يوسف ومارغريت DiSepio الشبكية صندوق أبحاث (MAZ) ، وميتشل فاسار جانيس وآشبي ميتشل زمالة (AMK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM | Invitrogen | 10370-021 | |
| 5 mL pipette tip | ISC BioExpress | P-3250-19 | |
| NUNC cell culture insert | Thermal Scientific, Inc. | 137443 | 8μm, Polycarbonate |
| Whatman 4M Filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1004 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| Agar | Fluka | 05040 | |
| Fungizone Amphotericin B | Invitrogen | 15290018 | |
| Trephine blades | Bausch and Lomb | T3096 | 6.00mm |
| O.C.T. Compound | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | 4583 |
| Cryostat | Leica Microsystems | CM1900 | |
| Vibratome | Leica Microsystems | Series 1000 | |
| Confocal microscopy; | Carl Zeiss, Inc. | LSM510 | |
| Anti-Synaptic Vesicle Protein 2 (SV2) mouse monoclonal antibody | DSHB | N/A | |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) polyclonal rabbit antibody | Dako | DAKO | |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 |
References
- Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 3503-3512 (2008).
- Kretz, A., Marticke, J. K., Happold, C. J., Schmeer, C., Isenmann, S. A primary culture technique of adult retina for regeneration studies on adult CNS neurons. Nat Protoc. 2, 131-140 (2007).
- Donovan, S. L., Dyer, M. A. Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures. Nat Protoc. 1, 2710-2718 (2006).
- Koizumi, A., Zeck, G., Ben, Y., Masland, R. H., Jakobs, T. C. Organotypic culture of physiologically functional adult mammalian retinas. PLoS One. 2, e221-e221 (2007).
- Lye, M. H., Jakobs, T. C., Masland, R. H., Koizumi, A. Organotypic culture of adult rabbit retina. J Vis Exp. , (2007).
- Ames, A., Li, Y. Y. 3rd, Heher, E. C., Kimble, C. R. Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na+ transport. J Neurosci. 12, 840-853 (1992).
- Kobuch, K. Maintenance of adult porcine retina and retinal pigment epithelium in perfusion culture: characterisation of an organotypic in vitro model. Exp Eye Res. 86, 661-668 (2008).
- Kaempf, S., Walter, P., Salz, A. K., Thumann, G. Novel organotypic culture model of adult mammalian neurosensory retina in co-culture with retinal pigment epithelium. J Neurosci Methods. 173, 47-58 (2008).
- Guduric-Fuchs, J. Immunohistochemical study of pig retinal development. Mol Vis. 15, 1915-1928 (2009).
- Chandler, M. J., Smith, P. J., Samuelson, D. A., MacKay, E. O. Photoreceptor density of the domestic pig retina. Vet Ophthalmol. 2, 179-184 (1999).
