Summary
여기 우리는 일주일 동안 성인 돼지의의 망막의 organotypic 문화 비용 효율적인 기술을 설명합니다. 간단히, 멸균 여과지는 맞춤 제작 스탠드 제기 삽입에 RPE 및 장소 photoreceptor 사이드 최대의 신경 망막 떠 사용되었습니다.
Abstract
동물 실험을 바꾸거나 줄일 수 있습니다 체외 모델에 대한 인식 수요가있다. 돼지의의 망막은 인간의 망막과 유사한 구조의 연결을 가지고 있으며, 따라서 인간의 망막 부상 퇴행성 질병의 메커니즘을 연구에 대한 가치있는 수종입니다. 여기서 우리는 도살장에서 얻은 눈에에서 분리된 돼지의 성인의 망막의 organotypic 문화 비용 효율적인 기술을 설명합니다. 앞쪽에 세그먼트를 제거 후 trephine 블레이드는 성인 돼지의 눈을의 후부 세그먼트에서 여러 신경 망막 - Bruch의 막이 - RPE - 맥락막 - 공막엔의 explants를 만드는 데 사용되었다. 무균 필터 종이 각 explant에서 신경 망막 떠 사용되었습니다. 필터 종이 망막 복합은 맞춤 제작 스탠드로 문화 접시의 바닥에서 거리가 개최되었습니다 삽입, 위에 (최대 photoreceptor 사이드) 교양되었습니다. 스탠드는 망막의 양쪽에 문화 매체를 잘 순환 수 있습니다. 전반적으로,이 절차는 재현성, 간단하고, 적어도 7 일 동안 기본 망막 구조의 보존을 허용, 그것 포유 동물 망막에서 형태학의 약리 및 생화학 연구의 다양한 유용 모델 만들기.
Protocol
1. 세포 배양 삽입에 대한 사용자 지정 만든 스탠드 만들기
5 ML 피펫 팁 (ISC BioExpress, # P - 3250-19)의 기본 완벽하게 10mm의 바닥 크기 (12.6 mm, 외경) (내경) NUNC 세포와 일치하는 13mm의 내경을 문화 삽입 (8 μm의, 폴리 카보 네이트 멤브레인, 열, # 137443). 스탠드를 만들기 위해 피펫은 6mm 롱 홀로 실린더를 생산하는 기지 근처에 차단했다. 그런 다음 조각은 약 5mm로 삽입의 높이를 제기 반지 (높이 2 ㎜), 아래의 세 다리 (높이 4mm)를 생성하기 위해 불꽃 - 가열 칼날을 사용하여 실린더의 측면에서 제거되었습니다.
2. 돼지의 망막의 부착과 문화에 대한 살균 필터 종이 준비
왓먼 4M 필터 용지 (CAT 번호 1004)는 (같은 살균 또는 일단 망막이 첨부되었습니다 유리관에 여과지를 이동에 사용했던 작은 삼각 손잡이 원형 모양 (직경 6.3 ㎜)으로 절단되었습니다 ) 동영상에 표시됩니다.
3. 망막 explants의 준비
5 아이즈 - 150~230파운드 오래된 9 개월은 미국 요크셔 돼지는 핵의 제거 3 시간 이내에 현지 도살장 (얼음 이송)에서 얻은되었습니다. 도착되면, 눈이 관계없는 조직의 청소했다, betadine 솔루션 (10 % Povidone - 요오드, 퍼듀 Frederique 회사, 스탬 포드, CT)에 담근과 Dulbecco의 변형 이글 중간 (1g / L 포도당과 DMEM, L - 글루타민 두 번 씻어 나트륨 pyruvate, Cellgro - mediatech 주식 회사, Manasses, VA)은 2.5 μg / ML Amphotericin B (Gibco - Invitrogen, 칼스 배드, CA)과 보완. 앞쪽에 세그먼트는 신경 망막를 노출, 제거되었습니다. 식스 - mm trephine 블레이드 (Storz 안과 - 바우와 롬, 맨체스터, MO)는 적도, 전체 두께 후부 세그먼트 explants를 잘라하는 데 사용되었습니다. 망막은 이후에 부드럽게, 신경절 세포 레이어에 건조 살균 필터 종이를 적용 신경 망막을 운반하고, 문화 삽입에 부착된 망막과 필터 종이를 배치, photoreceptors가 직면한에 의해 해제 벗겨했다. 삽입은 다음 12 잘 문화 요리 (피셔)에서 완벽하게 망막을 커버해야하고, 문화 매체에 게재되었습니다. 여러 explants는 일상적으로 취득하고 하나의 시선에서 교양되었습니다.
4. 조직 문화
망막 조직은 (멤, Invitrogen - Gibco - 생명 기술 주식 회사, 락빌, MD), 산도 7.4, 0.2 MG / ML 글루타민, 10 μg / ML 돼지의의 인슐린, 1 ㎜의 pyruvate, 0.1와 보충 이글의 최소 필수 매체 교양 MM L - 아스코르비 산, 100 U / ML 페니실린, 100 μg / ML 스트렙토 마이신, 250 NG / ML amphotericin B (Antimycotic 항생제 : 시그마, 세인트 루이스, MO), 그리고 humidified 5% CO 2, 균형 공기와 aerated, 37 ° C. 중간 이틀마다 교환했다.
조직은, 사용 시약 또는 프로브의 다양한 치료, 또는 이후 생화학 또는 형태학의 분석에 대한 치료 남아있을 수 있습니다. 아래의 섹션은 일관성있는 전체 두께 망막 크로스 섹션을 만드는 절차를 설명합니다.
5. Sectioning
- 그라 이오 스탯을 사용하여
- 4 밤새 4 % parafomaldehyde에서 망막 조직을 수정 ° C;
- 인산염은 생리 (PBS)를 버퍼로 간략하게 조직을 씻어;
- 그것은 해부 현미경을 사용하여 35mm 접시에 PBS에있는 동안 조심스럽게 여과지에서 조직을 제거;
- 30 % 자당에 조직을 전송하고 4 박 유지 ° C;
- 멀리 흡입 조직 주변의 과잉 솔루션은 조직을 커버하기에 충분한 조직 테크 매체 (OCT 컴파 운드 4,583) 추가하고 조직을 침투하기 위해 2 시간 동안 실온에서 흡수하게;
- 치과 왁스와 사각 프레임 (10mm X 10mm, 5mm 높이)를 구축하고 조직 주위에 그것을 장소, 냉동실에 프레임 (조직 샘플 평면 있는지 확인)과 자리를 채우기 위해 더 많은 조직 테크 미디어를 추가 (- 20 ° C) 적어도 1 시간;
- 샘플 플랫폼 (샘플 블록은 플랫폼에 수직으로되어 있는지 확인)에 냉동 샘플 블록을 전송;
- 예비 냉각 그라 이오 스탯의 예제 플랫폼을 마운트 (-20 ° C, Leica, CM1900)와 블록이 블레이드에 수직으로되어 있는지 확인하십시오;
- 원하는 두께의 조직을 sectioning 전에 왁스와 프레임 블록을 제거합니다;
- 젤라틴 - 처리 슬라이드에있는 섹션을 놓으십시오.
- Vibratome를 사용
- 수정 및 그라 이오 스탯을 위해 위에 설명된대로 조직을 씻어;
- 작은 용기에 미리 가열, 녹인 4 % 한천로 조직을 놓고 ° C 한천 확대해까지 완전히 4 유지;
- 내부 조직 샘플과 작은 블록으로 한천을 장식하기 위해 날카로운 칼날을 사용;
- Krazy 접착제와 vibratome 샘플 홀더 (조직 샘플의 조각 세기의 플랫폼에 수직으로되어 있는지 확인에 접착제 샘플 블록E 샘플 홀더, 즉 수직 블레이드)와 완전히 얼음 물 속에 빠져들 샘플 블록과 vibratome sectioning 시스템 (Leica, 시리즈 1000)의 보유자 마운트;
- 50 μm의 섹션에 샘플 블록을 잘라 부드러운 브러시로 젤라틴 - 대우 슬라이드에 올려 놓으십시오.
6. Immunohistochemistry
모든 표준 프로토콜을 사용합니다. Immunolabeled 두께의 섹션은 공촛점 현미경으로 볼 수 있습니다.
7. 대표 결과 :
형태는 문화의 7 일의 기간 동안 보존되었다. culturing 전후 망막의 이미지는 동영상에서 사용할 수 있습니다.
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Discussion
비전 연구자는 망막 줄기 세포 이식 1, 망막 재생 2, 외인성 유전자 발현 3-5로 문제의 다양한 연구를 organotypic 시스템을 포함한 망막 문화 시스템의 다양한 설립했습니다. 그러나, 성인 포유류의 망막은 체외에서 photoreceptors 6 높은 에너지 요구에 주로 인해 유지하기 어렵습니다. 고이즈미 외가. photoreceptors에 대한 산소 공급이 문화 삽입의 높이를 제기하고 문화 매체를 agitating하여 ameliorated어진 토끼 망막 organotypic 문화 시스템을 설명했다. 그들은 성공적으로 육일 4,5에 최대 성인 망막 조직을 유지. Kobuch 외가. 성인 돼지의 망막과 망막의 색소 상피 (RPE)에 대한 재관류 문화 시스템을 설명하고 최소 10 일 7 organotypic 조직을 유지할 수 있었다. 그러나, 실험실 조작을위한 망막 - RPE - 맥락막 시트를 준비 절차는 복잡하고 특별한 도구가 필요했습니다. 또한, 각 explant은 성가신 여러 조직 샘플의 체외 배양에 제작 자체 재관류 시스템을 필요합니다. . Kaempf 외 성공적으로 RPE 공동 문화에 성인 포유 동물 neurosensory 망막의 다른 organotypic 문화 모델을 만들지만, 단 3 일 문화의 결과를 보여, 조직의 장기적인 생존은 8 테스트되지 않았습니다.
이 원고에서는, 우리는 이전에 다음과 같은 기능을 토끼 망막 4 설명한 것과 유사한 방식을 채택 성인 돼지의 신경 망막의 organotypic 문화 간단하고 재현성 프로토콜 설명 :
- 전체 망막의 explant 좋은 산소 공급을 보장, 문화 삽입의 높이를 마련하기 위해 사용자 정의 서를 만들기 위해 간단한 기술의 창조. 스탠드를 만드는 5 ML의 피펫 팁을 사용하면 스탠드가 autoclaved 수 및 원하는 경우 높이를 조정할 수 보장합니다.
- 신경절 세포 레이어 반대로, 위쪽을 향하고 photoreceptor 층과 망막의 문화. 이러한 방법으로 photoreceptors 산소에 대한 액세스를 증가하고, 추가로 산소 공급을 강화하기 위해 교반 필요가 없습니다.
- 기계적 외상의 최소화. 망막 explants는 RPE에서 그들을 필링 전에 멸균 여과지에 연결된 다음 필터 종이에 양식되며, 따라서 조직에 기계적인 스트레스를 줄이고 망막 컬링을 방지.
- 망막 explants의 크기의 일관성. trephine이 explants를 만드는 데 사용되기 때문에, 각 망막 explant 이는 쉽게 다양한 치료의 결과를 비교할 수 있도록, 같은 크기입니다.
- 형태의 보존. 이 문화의 시스템에있는 돼지의 망막의 구조 적어도 이레 동안 그대로 유지됩니다.
돼지의 인간 망막이 세포 분포 및 형태, 혈관 패턴, 층 두께, 및 기타 physiologic 특성 9,10 측면에서 매우 유사한 것을 감안할 때, 돼지의 망막의 organotypic 문화, 인간의 망막 질환의 발현을 연구를위한 매력적인 동물 모델을 제공합니다 degenerations 및 부상. 이 시스템은 인간의 망막에 체외 실험에 의해, 부분적으로 높은 품질의 인간 조직의 부족을 수행하기 어려운 경우에 특히 중요있을 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH 교부금 어이 012,031 (동부 표준시 - A), 실명, 주식 회사 (MAZ), 뉴저지 라이온스 안구 연구 재단 (MAZ)을 방지하기 위해 FM 커비 재단 (동부 표준시 - A), 연구에서 수상에 의해 지원되었다 뉴저지 (MAZ), 조셉 J.와 마거리트 DiSepio 망막 연구 기금 (MAZ)와 재니스 미첼 바사르 및 애쉬비 미첼 원정대 (AMK)의 아이 연구소.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM | Invitrogen | 10370-021 | |
| 5 mL pipette tip | ISC BioExpress | P-3250-19 | |
| NUNC cell culture insert | Thermal Scientific, Inc. | 137443 | 8μm, Polycarbonate |
| Whatman 4M Filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1004 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| Agar | Fluka | 05040 | |
| Fungizone Amphotericin B | Invitrogen | 15290018 | |
| Trephine blades | Bausch and Lomb | T3096 | 6.00mm |
| O.C.T. Compound | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | 4583 |
| Cryostat | Leica Microsystems | CM1900 | |
| Vibratome | Leica Microsystems | Series 1000 | |
| Confocal microscopy; | Carl Zeiss, Inc. | LSM510 | |
| Anti-Synaptic Vesicle Protein 2 (SV2) mouse monoclonal antibody | DSHB | N/A | |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) polyclonal rabbit antibody | Dako | DAKO | |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 |
References
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