Summary
Hier beschrijven we een kosteneffectieve techniek voor organotypische cultuur van volwassen varkens netvlies gedurende zeven dagen. In het kort werd een steriel filtreerpapier wordt gebruikt om de neurale netvlies lift af van de RPE en plaats fotoreceptor kant naar boven op een insert opgevoed door een op maat gemaakte stand.
Abstract
Er is een erkende vraag naar in vitro modellen die kunnen vervangen of verminderen dierproeven. Varkens netvlies heeft een vergelijkbare neuronale structuur van de menselijke retina en is daarom een waardevolle soorten voor het bestuderen van de mechanismen van de menselijke netvlies letsel en degeneratieve ziekte. Hier beschrijven we een kosteneffectieve techniek voor organotypische cultuur van volwassen varkens geïsoleerd netvlies van de ogen verkregen uit een slachthuis. Na het verwijderen van het voorste segment, was een trephine mes gebruikt om meerdere neurale netvlies-Bruch's membraan-RPE-vaatvlies-sclera explantaten van het achterste segment van de volwassen varkens ogen te creëren. Een stuk steriel filtreerpapier werd gebruikt om de neurale netvlies lift off van elk explantatie. Het papieren filter-netvlies complex werd gekweekt (fotoreceptor kant naar boven), boven op een insert, die weg was gehouden van de bodem van de cultuur schotel door een op maat gemaakte stand. De stand zorgt voor een goede circulatie van het kweekmedium aan beide zijden van het netvlies. Het geheel genomen is deze procedure is eenvoudig, reproduceerbaar, en laat het behoud van inheemse netvlies structuur voor ten minste zeven dagen, waardoor het een bruikbaar model voor een verscheidenheid van morfologische, farmacologische en biochemische studies over zoogdieren netvlies.
Protocol
1. Het maken van een custom-made staan voor celkweek inserts
De basis van een 5 ml pipet tip (ISC BioExpress, # P-3250-19) heeft een binnendiameter van 13 mm, die perfect overeenkomt met de onderkant afmeting (12,6 mm, buitendiameter) van een 10 mm (binnendiameter) NUNC cel cultuur insert (8 micrometer, polycarbonaat membraan, Thermal, # 137443). Om de stand, was de pipet afgesneden de buurt van de basis om een 6 mm lange holle cilinder te produceren. Daarna werden stukken uit de kant van de cilinder met behulp van een vlam verwarmd mes om drie poten (4 mm in de hoogte) te maken onder een ring (2 mm in de hoogte), die de hoogte van de inserts verhoogd met ongeveer 5 mm.
2. Bereiding van steriele filter papier voor de bevestiging en de cultuur van varkens netvlies
Whatman 4M Filtreerpapier (Cat nr. 1004) werd gesneden in een ronde vorm (6,3 mm in diameter) met een klein, driehoekig handvat dat werd gebruikt voor het verplaatsen van de filter papier in een glazen buis voor sterilisatie of eenmaal het netvlies was verbonden (zoals weergegeven in de video).
3. De voorbereiding van het netvlies explanten
Ogen van 5 - tot 9-maanden oude, 150-230 pond, waren Amerikaanse Yorkshire varkens afkomstig van een lokaal slachthuis binnen drie uur na enucleatie (vervoerd op ijs). Bij aankomst, de ogen waren ontdaan van vreemde weefsel, gedompeld in Betadine oplossing (10% povidon-jodium, De Purdue Frederique Company, Stamford, CT) en tweemaal gewassen in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM met 1 g / L glucose, L-glutamine, en natrium pyruvaat, Cellgro-Mediatech Inc, Manasse, VA), aangevuld met 2,5 ng / ml amfotericine B (Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA). De voorste segment werd verwijderd, waardoor de neurale netvlies. Zes-mm trephine bladen (Storz Oogheelkundige-Bausch en Lomb, Manchester, MO) werden gebruikt om equatoriale, volledige dikte achterste segment explantaten snijden. Het netvlies werd vervolgens afgepeld door voorzichtig het toepassen van een stuk droog steriel filtreerpapier op de ganglion cellaag, til de neurale netvlies, en het plaatsen van de filter papier met aangehechte netvlies op de cultuur te voegen, fotoreceptoren naar boven. De insert werd vervolgens geplaatst in kweekmedium, en zorg ervoor dat volledig te dekken het netvlies, in een 12-well cultuur schotel (Fisher). Meerdere explantaten werden routinematig verkregen en gekweekt uit een enkele oog.
4. Weefselkweek
De retinale weefsel werd gekweekt in Minimum Essential Medium Eagle's (MEM, Invitrogen-Gibco-Life Technologies Inc, Rockville, MD), pH 7.4, aangevuld met 0,2 mg / ml glutamine, 10 ug / ml varkens insuline, 1 mM pyruvaat, 0,1 mM L-ascorbinezuur, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, en 250 ng / ml amfotericine B (een antibioticum Antimycoticum: Sigma, St. Louis, MO), en belucht met bevochtigde 5% CO 2, balans lucht, bij 37 ° C. Medium werd uitgewisseld om de twee dagen.
Weefsel kan worden gebruikt, behandeld met een verscheidenheid van reagentia of sondes, of onbehandeld voor latere biochemische of morfologische analyses. De sectie beschrijft de procedures te creëren consistente volledige dikte van het netvlies doorsneden.
5. Snijden
- Met behulp van een Cryostaat
- Fix retinaal weefsel in 4% parafomaldehyde overnacht bij 4 ° C;
- Spoel kort weefsel met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS);
- Verwijder voorzichtig het weefsel van de filter papier terwijl deze in PBS in een 35 mm schaal met behulp van een dissectie microscoop;
- Overdracht weefsel tot 30% sucrose en overnacht bij 4 ° C te houden;
- Zuiging weg de overtollige oplossing rond het weefsel, voeg voldoende Tissue-Tek medium (LGO Compound 4583) om weefsel te dekken, en laat het op kamertemperatuur gedurende 2 uur om het weefsel doordringen;
- Bouwen van een vierkant frame (10 mm x 10 mm, 5 mm hoog) met tandartsen en plaats het rond het weefsel, voeg meer Tissue-Tek medium aan het frame (zorg ervoor dat het weefselmonster plat is) en plaats het in een vriezer te vullen (- 20 ° C) gedurende ten minste 1 uur;
- Breng het bevroren monster blok om een sample platform (zorg ervoor dat het monster blok is loodrecht op het platform);
- Monteer het monster platform in een pre-gekoelde cryostaat (-20 ° C, Leica, CM1900) en zorg ervoor dat het blok is loodrecht op het blad;
- Haal de was en het frame blok voor het snijden van het weefsel op de gewenste dikte;
- Plaats de hoofdstukken over gelatine-behandelde dia's.
- Met behulp van een Vibratome
- Fix en spoel het weefsel zoals hierboven beschreven voor de cryostaat;
- Leg het weefsel in voorverwarmde, gesmolten 4% agar in een kleine container en houd bij 4 ° C tot de agar stolt volledig;
- Gebruik een scherp mes om de agar trimmen in een kleine blok met het weefselmonster binnen;
- Lijm het monster blok op een vibratome monsterhouder met Krazy lijm (zorg ervoor dat het stukje weefsel monster wordt loodrecht op het platform van ee monsterhouder, dat wil zeggen, loodrecht op het blad) en monteer de houder op een vibratome snijden systeem (Leica, serie 1000) met het monster blok volledig ondergedompeld in ijskoud water;
- Snijd de sample blok in 50 um secties en leg ze op gelatine behandeld dia's met een zachte borstel.
6. Immunohistochemie
Gebruik een standaard protocol. Immunolabeled dikke secties kunnen worden bekeken met een confocale microscoop.
7. Representatieve resultaten:
Morfologie behouden tijdens de periode van zeven dagen van de cultuur. Foto's van het netvlies voor en na het kweken zijn beschikbaar in de video.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vision onderzoekers hebben een verscheidenheid van het netvlies cultuur, met inbegrip van organotypische systemen, om een verscheidenheid van onderwerpen, zoals het netvlies stamceltransplantatie 1, retinale regeneratie 2, en exogene genexpressie 3-5 te bestuderen. Echter, volwassen zoogdieren netvlies is moeilijk vol te houden in vitro, voornamelijk als gevolg van de hoge energie-eisen van de fotoreceptoren 6. Koizumi et al.. Beschreef een konijn netvlies organotypische cultuur systeem waarbij de zuurstoftoevoer voor de fotoreceptoren werd verbeterd door het verhogen van de hoogte van de cultuur te voegen en schudden van de kweekmedium. Zij met succes onderhouden volwassen retinaal weefsel gedurende maximaal zes dagen 4,5. Kobuch et al.. Beschreef een perfusie cultuur systeem voor volwassen varkens netvlies en retinale pigment epitheel (RPE) en waren in staat om de organotypische weefsel gedurende ten minste 10 dagen 7. Echter, werd de procedure voor de voorbereiding van het netvlies-vaatvlies RPE-sheets voor laboratorium manipulatie gecompliceerde en speciaal gereedschap nodig. Bovendien heeft elk explantatie vereist zijn eigen perfusie systeem waarbij in vitro cultuur van meerdere weefselmonsters omslachtig. . Kaempf et al. succesvol aangemaakt andere organotypische cultuur model van de volwassen zoogdieren neurosensorische netvlies in co-cultuur met RPE, maar alleen liet resultaten voor een drie-dagen cultuur, op de lange termijn overleving van het weefsel werd niet getest 8.
In dit manuscript beschrijven we een eenvoudige en reproduceerbare protocol voor organotypische cultuur van volwassen varkens neurale netvlies tot vaststelling van een benadering vergelijkbaar met die eerder beschreven voor konijn netvlies 4 met de volgende kenmerken:
- Oprichting van een eenvoudige techniek om een aangepaste stand te brengen in de hoogte van de cultuur insert te verhogen, zorgen voor een goede zuurstoftoevoer voor het hele netvlies explantaat. Met behulp van een 5 ml pipet tip aan de stand maken zorgt ervoor dat de stand kan worden geautoclaveerd en dat de hoogte kan worden aangepast indien gewenst.
- Cultuur van het netvlies met de fotoreceptor laag naar boven, in tegenstelling tot het ganglion cel laag. Op deze manier hebben de fotoreceptoren betere toegang tot zuurstof, en agitatie om verdere vergroting van de toevoer van zuurstof is niet nodig.
- Minimalisering van de mechanische trauma. Het netvlies explantaten zijn verbonden aan steriel filtreerpapier voordat schillen ze uit de RPE en daarna worden gekweekt op het filter papier, waardoor de mechanische spanning op het weefsel en het voorkomen van het netvlies curling.
- Consistentie in de grootte van het netvlies explantaten. Omdat een trephine wordt gebruikt om de explantaten te maken, elk netvlies Explantatie is van dezelfde grootte, waardoor het eenvoudiger is om de resultaten van verschillende behandelingen te vergelijken.
- Behoud van de morfologie. Structuur van de varkens netvlies in deze cultuur systeem blijft intact voor ten minste zeven dagen.
Gezien het feit dat varkens en menselijke netvlies zijn zeer vergelijkbaar in termen van cel-distributie en morfologie, vasculaire patroon, laagdikte en andere fysiologische kenmerken 9,10, de organotypische cultuur van varkens netvlies biedt een aantrekkelijk diermodel voor het bestuderen van uitingen van de menselijke netvlies ziekten, degeneraties, en verwondingen. Dit systeem kan met name van belang zijn in gevallen waarin de in vitro experimenten op de menselijke netvlies zijn onmogelijk uit te voeren ten dele, het gebrek aan kwalitatief hoogwaardige menselijk weefsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie EY 012.031 (ET-A), een prijs van de FM-Kirby Foundation (ET-A), Onderzoek om Blindheid, Inc (MAZ), The New Jersey Lions Eye Research Foundation (MAZ) Prevent, De Eye Institute van de New Jersey (MAZ), de Joseph J. en Marguerite DiSepio Retina Research Fund (MAZ), en de Janice Mitchell Vassar en Ashby Mitchell Fellowship (AMK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM | Invitrogen | 10370-021 | |
| 5 mL pipette tip | ISC BioExpress | P-3250-19 | |
| NUNC cell culture insert | Thermal Scientific, Inc. | 137443 | 8μm, Polycarbonate |
| Whatman 4M Filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1004 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| Agar | Fluka | 05040 | |
| Fungizone Amphotericin B | Invitrogen | 15290018 | |
| Trephine blades | Bausch and Lomb | T3096 | 6.00mm |
| O.C.T. Compound | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | 4583 |
| Cryostat | Leica Microsystems | CM1900 | |
| Vibratome | Leica Microsystems | Series 1000 | |
| Confocal microscopy; | Carl Zeiss, Inc. | LSM510 | |
| Anti-Synaptic Vesicle Protein 2 (SV2) mouse monoclonal antibody | DSHB | N/A | |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) polyclonal rabbit antibody | Dako | DAKO | |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 |
References
- Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 3503-3512 (2008).
- Kretz, A., Marticke, J. K., Happold, C. J., Schmeer, C., Isenmann, S. A primary culture technique of adult retina for regeneration studies on adult CNS neurons. Nat Protoc. 2, 131-140 (2007).
- Donovan, S. L., Dyer, M. A. Preparation and square wave electroporation of retinal explant cultures. Nat Protoc. 1, 2710-2718 (2006).
- Koizumi, A., Zeck, G., Ben, Y., Masland, R. H., Jakobs, T. C. Organotypic culture of physiologically functional adult mammalian retinas. PLoS One. 2, e221-e221 (2007).
- Lye, M. H., Jakobs, T. C., Masland, R. H., Koizumi, A. Organotypic culture of adult rabbit retina. J Vis Exp. , (2007).
- Ames, A., Li, Y. Y. 3rd, Heher, E. C., Kimble, C. R. Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na+ transport. J Neurosci. 12, 840-853 (1992).
- Kobuch, K. Maintenance of adult porcine retina and retinal pigment epithelium in perfusion culture: characterisation of an organotypic in vitro model. Exp Eye Res. 86, 661-668 (2008).
- Kaempf, S., Walter, P., Salz, A. K., Thumann, G. Novel organotypic culture model of adult mammalian neurosensory retina in co-culture with retinal pigment epithelium. J Neurosci Methods. 173, 47-58 (2008).
- Guduric-Fuchs, J. Immunohistochemical study of pig retinal development. Mol Vis. 15, 1915-1928 (2009).
- Chandler, M. J., Smith, P. J., Samuelson, D. A., MacKay, E. O. Photoreceptor density of the domestic pig retina. Vet Ophthalmol. 2, 179-184 (1999).
