Summary
Nous décrivons ici une technique rentable pour la culture organotypique de la rétine porcine adulte pour sept jours. En bref, un papier filtre stérile a été utilisé pour soulever la rétine neurale décollé de l'EPR et le côté photorécepteur lieu sur un insert soulevées par un stand sur mesure.
Abstract
Il ya une demande reconnue pour des modèles in vitro qui peuvent remplacer ou de réduire l'expérimentation animale. Rétine porcin a une structure similaire à la rétine humaine neuronale et est donc une espèce précieuse pour l'étude des mécanismes de blessure rétinienne humaine et les maladies dégénératives. Nous décrivons ici une technique rentable pour la culture organotypique de la rétine porcine adulte isolé yeux obtenue à partir d'un abattoir. Après avoir retiré le segment antérieur, une lame de trépan a été utilisé pour créer de multiples neurones rétine Bruch membrane RPE-choroïde-sclérotique explants du segment postérieur des yeux de porc adulte. Un morceau de papier filtre stérile a été utilisé pour soulever la rétine neurale hors de chaque explant. Le filtre en papier-rétine complexes a été cultivé (côté photorécepteur vers le haut) au sommet d'un insert, qui a eu lieu loin de la bas de la boîte de culture par un stand sur mesure. Le stand permet une bonne circulation du milieu de culture des deux côtés de la rétine. Globalement, cette procédure est simple, reproductible, et permet la préservation de la structure de la rétine natif pour au moins sept jours, ce qui en fait un modèle utile pour une variété d'études morphologiques, pharmacologiques et biochimiques sur la rétine des mammifères.
Protocol
1. Faire un stand sur mesure pour inserts de culture cellulaire
La base d'une pointe de la pipette 5 ml (ISC BioExpress, # P-3250-19) a un diamètre intérieur de 13 mm, ce qui correspond parfaitement à la taille inférieure (12,6 mm, diamètre extérieur) d'un 10 mm (diamètre interne) de cellules NUNC insert de culture (8 pm, membrane en polycarbonate, thermique, # 137443). Pour rendre le stand, la pipette a été coupé près de la base pour produire un long cylindre de 6 mm creux. Ensuite, les morceaux ont été retirés du côté du cylindre à l'aide d'une lame chauffée à la flamme afin de créer trois pattes (4 mm de hauteur) dans le cadre d'un anneau (2 mm de hauteur), qui a soulevé la hauteur des inserts d'environ 5 mm.
2. Préparation du papier filtre stérile pour la fixation et à la culture de la rétine porcine
Whatman 4M papier filtre (Cat n ° 1004) a été coupé dans une forme circulaire (6,3 mm de diamètre) avec une petite poignée triangulaire qui a été utilisé pour déplacer le papier filtre dans un tube de verre pour la stérilisation ou une fois la rétine a été fixé (comme montré dans la vidéo).
3. Préparation des explants rétiniens
Yeux de 5 - à 9 mois vieux, 150-230 lbs, American porcs Yorkshire ont été obtenus à partir d'un abattoir local dans les trois heures de l'énucléation (transporté sur glace). À leur arrivée, les yeux ont été nettoyées des tissus étrangers, plongé dans une solution de bétadine (10% de povidone-iode, La Société de Purdue Frédérique, Stamford, CT) et lavé à deux reprises en milieu Dulbecco modifié Eagle (DMEM avec 1g / L de glucose, L-glutamine, et le pyruvate de sodium, Cellgro-mediatech Inc, Manassé, VA) complémenté avec 2,5 pg / ml d'amphotéricine B (Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA). Le segment antérieur a été retirée, exposant la rétine neurale. Six mm lames trépan (Storz-ophtalmique Bausch and Lomb, Manchester, MO) ont été utilisés pour couper l'équateur, de pleine épaisseur explants segment postérieur. La rétine est décollée par la suite délicatement appliquant un morceau de papier filtre stérile sec sur la couche de cellules ganglionnaires, soulevant la rétine neurale, et de placer le papier filtre avec la rétine attachée sur l'insert de la culture, les photorécepteurs vers le haut. L'insert a été ensuite placé dans un milieu de culture, en veillant à couvrir entièrement la rétine, dans une boîte de culture à 12 puits (Fisher). Explants multiples ont été obtenues régulièrement et cultivé à partir d'un seul œil.
4. La culture de tissus
Le tissu rétinien a été cultivé à Eagle milieu minimum essentiel (MEM, Invitrogen Gibco-Life-Technologies Inc, Rockville, MD), pH 7,4, additionné de 0,2 mg / ml de glutamine, 10 insuline porcine pg / ml, 1 mM de pyruvate, de 0,1 mM acide L-ascorbique, 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine et 250 ng / ml d'amphotéricine B (antibiotiques Antimycosique: Sigma, St. Louis, MO), et aérés avec humidifié à 5% de CO 2, l'air l'équilibre, à 37 ° C. Le milieu est changé tous les deux jours.
Les tissus peuvent être utilisés, traités avec une variété de réactifs ou de sondes, ou elle n'est pas traitée pour la suite des analyses biochimiques ou morphologiques. La section ci-dessous décrit les procédures pour créer des cohérente de pleine épaisseur rétinienne sections.
5. Sectionnement
- L'utilisation d'un cryostat
- Fixer le tissu rétinien au parafomaldehyde 4% la nuit à 4 ° C;
- Rincer brièvement avec les tissus tampon phosphate salin (PBS);
- Retirer délicatement le tissu du papier filtre pendant qu'il est en PBS dans un plat de 35 mm en utilisant un microscope à dissection;
- Transfert des tissus à 30% de sucrose et de garder une nuit à 4 ° C;
- Aspiration loin l'excès de solution à travers le tissu, ajouter suffisamment Tissue-Tek moyennes (composé OCT 4583) pour couvrir les tissus, et laissez-le tremper à température ambiante pendant 2 heures à imprégner le tissu;
- Construire un cadre carré (10 mm x 10mm, 5 mm de hauteur) avec de la cire dentaire et le placer autour du tissu; ajouter plus Tissue-Tek moyenne pour remplir le cadre (assurez-vous que l'échantillon de tissu est plat) et placer dans un congélateur (- 20 ° C) pendant au moins 1 heure;
- Transférer le bloc de l'échantillon congelé à une plate-forme de l'échantillon (assurez-vous que le bloc de l'échantillon est perpendiculaire à la plate-forme);
- Monter la plate-forme de l'échantillon dans un cryostat pré-refroidi (-20 ° C, Leica, CM1900) et assurez-vous que le bloc est perpendiculaire à la lame;
- Enlever la cire et le bloc de châssis avant de sectionner le tissu à l'épaisseur désirée;
- Placez les sections sur la gélatine traitée diapositives.
- L'utilisation d'un Vibratome
- Fix et rincer le tissu comme décrit ci-dessus pour le cryostat;
- Placer le tissu en pré-chauffée, 4% d'agar fondu dans un petit récipient et maintenir à 4 ° C jusqu'à ce que l'agar se fige complètement;
- Utilisez une lame tranchante pour couper l'agar-agar dans un petit bloc avec l'échantillon de tissu à l'intérieur;
- Collez le bloc de l'échantillon sur un porte-échantillon vibratome avec Krazy Glue (assurez-vous que le morceau de l'échantillon de tissu est perpendiculaire à la plate-forme de ee porte-échantillon, c'est à dire, perpendiculaire à la lame) et monter le support sur un système vibratome sectionnement (Leica, série 1000) avec le bloc de l'échantillon complètement immergé dans l'eau glacée;
- Couper le bloc de l'échantillon dans 50 sections um et les placer sur la gélatine traitée lames avec une brosse douce.
6. L'immunohistochimie
Utiliser tout protocole standard. Immunomarquées sections épaisses peuvent être visualisées avec un microscope confocal.
7. Les résultats représentatifs:
Morphologie a été préservée durant la période de sept jours de culture. Les images de la rétine, avant et après mise en culture sont disponibles dans la vidéo.
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Discussion
Vision chercheurs ont établi une variété de systèmes de culture de la rétine, y compris les systèmes organotypiques, pour étudier une variété de questions, telles que des cellules souches rétiniennes transplantation 1, de la régénération rétinienne 2, et l'expression des gènes exogènes 3-5. Toutefois, les adultes rétine des mammifères est difficile à maintenir in vitro, principalement due à la forte demande en énergie des 6 photorécepteurs. Koizumi et al. Décrit un lapin système rétinien culture organotypique dans laquelle la fourniture d'oxygène pour les photorécepteurs a été amélioré en augmentant la hauteur de l'insert de culture et en agitant le milieu de culture. Ils ont réussi à maintenir un tissu adulte rétinienne pour jusqu'à six jours 4,5. Kobuch et al. Décrit un système de culture de perfusion pour la rétine porcine adulte et l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) et ont réussi à maintenir le tissu organotypique pendant au moins 10 jours 7. Toutefois, la procédure de préparation des feuilles rétine RPE-choroïdes pour la manipulation en laboratoire a été compliquée et nécessitait des outils spéciaux. En outre, chaque explant nécessaire de son système de perfusion propres décisions en culture in vitro de plusieurs échantillons de tissus encombrants. . Kaempf et al créé avec succès un autre modèle de culture organotypique de l'adulte rétine neurosensorielle de mammifères en co-culture avec l'EPR, mais seulement montré des résultats pour une culture de 3 jours, la survie à long terme du tissu n'a pas été testé huit.
Dans ce manuscrit, nous décrivons un protocole simple et reproductible pour la culture organotypique de porc rétine adulte neurones adoptant une approche similaire à celle décrite précédemment pour 4 rétine de lapin avec les caractéristiques suivantes:
- Création d'une technique simple pour faire un stand sur mesure pour augmenter la hauteur de l'insert de culture, d'assurer l'approvisionnement en oxygène bon pour l'explant rétine entière. En utilisant une pointe de la pipette 5 ml de créer le stand assure que le stand ne peut être autoclavés et que la hauteur peut être ajustée, si désiré.
- Culture de la rétine avec la couche des photorécepteurs vers le haut, par opposition à la couche de cellules ganglionnaires. De cette façon, les photorécepteurs ont un accès accru à de l'oxygène, et l'agitation de renforcer plus encore l'apport en oxygène n'est pas nécessaire.
- Minimisation des traumatismes mécaniques. Les explants rétiniens sont attachés au papier filtre stérile avant de les éplucher des RPE et sont cultivés sur le papier filtre, réduisant ainsi les contraintes mécaniques sur le tissu et la prévention de la rétine de curling.
- Cohérence de la taille des explants rétiniens. Parce qu'un trépan est utilisé pour créer les explants, chaque explant la rétine est de la même taille, ce qui rend facile de comparer les résultats des différents traitements.
- Préservation de la morphologie. Structure de la rétine porcine dans ce système de culture reste intacte pendant au moins sept jours.
Étant donné que porcine et de la rétine humaine sont très similaires en termes de distribution des cellules et la morphologie, la structure vasculaire, épaisseur de la couche, et d'autres caractéristiques physiologiques 9,10, la culture organotypique de la rétine porcine fournit un modèle animal pour étudier attractif manifestations de maladies de la rétine humaine, dégénérescences, et les blessures. Ce système peut être particulièrement important dans les cas où des expériences in vitro sur la rétine humaine sont impossibles à réaliser en raison, en partie, au manque de qualité des tissus humains.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par NIH EY 012 031 (ET-A), un prix décerné par la Fondation FM Kirby (ET-A), de la recherche pour prévenir la cécité, Inc (MAZ), le nouveau maillot des Lions Eye Research Foundation (MAZ), L'Institut de l'oeil du New Jersey (MAZ), le juge Joseph et Marguerite DiSepio Retina Research Fund (MAZ), et l'Janice Mitchell Vassar et Ashby Mitchell Fellowship (AMK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEM | Invitrogen | 10370-021 | |
| 5 mL pipette tip | ISC BioExpress | P-3250-19 | |
| NUNC cell culture insert | Thermal Scientific, Inc. | 137443 | 8μm, Polycarbonate |
| Whatman 4M Filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1004 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| Agar | Fluka | 05040 | |
| Fungizone Amphotericin B | Invitrogen | 15290018 | |
| Trephine blades | Bausch and Lomb | T3096 | 6.00mm |
| O.C.T. Compound | Electron Microscopy Sciences | 62550-01 | 4583 |
| Cryostat | Leica Microsystems | CM1900 | |
| Vibratome | Leica Microsystems | Series 1000 | |
| Confocal microscopy; | Carl Zeiss, Inc. | LSM510 | |
| Anti-Synaptic Vesicle Protein 2 (SV2) mouse monoclonal antibody | DSHB | N/A | |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) polyclonal rabbit antibody | Dako | DAKO | |
| Propidium Iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 |
References
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