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Biology

Cardiogenic 유도 효율을 Quantifying에 대한 수정 마우스 배아의 줄기 세포 기반 어세이

doi: 10.3791/2656 Published: April 22, 2011

Summary

우리는 / β - catenin Wnt와 cardiogenic 유도하는 동안 BMP 신호 활성화를위한 중요한 시간 윈도우를 식별하는 마우스 ES 세포 기반 분석의 사용을 설명합니다. 방법은 안정 cardiogenic 효율성을 단정 표준화된 플랫폼을 제공하고, 다른 세포 lineages의 연구에 적용됩니다.

Abstract

pluripotent 줄기 세포의 분화는 밀접하게 여러 주요 신호 경로의 시간적 및 공간적 규정에 의해 제어됩니다. 의 이해에 장애물 중 하나는 분화의 효율을 주요 신호 이벤트의 변경 내용을 연관의 다양한 방법을하고 있습니다. 우리는 여기서 / β - catenin Wnt와 cardiogenic 유도하는 동안 BMP 신호 활성화를위한 중요한 시간 윈도우를 식별하는 마우스 배아 줄기 (ES) 세포 기반 분석의 사용을 설명합니다. 96 - 웰 플레이트 형식으로 배아 기관 (EBS)을 계약에 대한 점수로, 우리는 신속하게 cardiogenic 효율성을 계량 및 / Wnt β - catenin 및 특정 변조기 트리 트먼트 다음 시간 코스 BMP 신호 활성화를위한 중요한 시간 창을 확인할 수 있습니다. 여기에 설명된 교장 선생님은 혼자 심장 유도에 한정되지 않고 여러 셀 lineages의 연구 방향으로 적용할 수 있습니다. 또한, 96 - 웰 형식은 더 높은 처리량, 더 정교한 실험 가설의 시험 수 있도록 자동화된 분석으로 개발할 수있는 잠재력이 있습니다.

Protocol

1. 잘 microtiter 접시를 96 라운드 바텀를 사용하여 배아 바디 (EB) 형성

  1. 난생과 보충 마우스 ES 세포 매체와 10cm의 세포 배양 접시에 마우스 ES 세포를 성장.
  2. ES 세포는 (일반적으로 50~70%의 합류에서) 사용을위한 준비가되면, ES 미디어를 제거하고 멸균 PBS 5ml로 한 세포를 씻어.
  3. 3 ~ 5 분 37 각 플레이트와 부화 플레이트 ° C에 2ml 0.05 % 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 추가, 3 ML ES 매체와 트립신 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)이 끄다.
  4. 3 분 1,000 rpm으로 50ml 팔콘 튜브와 스핀에 세포를 전송합니다.
  5. 뜨는 제거하고, resuspend 세포 펠릿 EB 미디어의 원하는 금액과 함께.
  6. 휴대폰 번호를 카운트하고 EB 미디어 5 X10 3 셀 / ML로 세포를 희석.
  7. 라운드 잘 microtiter 접시 - 96 각 우물에 세포를 포함 EB 미디어 100μl를 추가하는 멀티채널 피펫을 사용합니다.
  8. 플레이스 96 - 인큐베이터에 둥근 잘 microtiter 접시.

2. cardiogenesis에 대한 주요 신호 경로 (S)의 중요한 시간 창을 확인

  1. 각 96 예 일 0 일 1 일 2 일 3 일 4 우물의 등 반 등 다양한 시간 지점에서 ES 세포를 포함하는 96 - 웰 microtiter 플레이트의 각 우물에 특정 신호 경로 및 차량 제어 모듈 레이터 추가 - 잘 플레이트는 (48 웰스) 치료의 각 시작 시점에 사용됩니다.
  2. 다른 정지 시간 지점에서 매 48 우물을위한 EB 미디어를 변경하여 모듈 레이터를 씻으십시오. 예를 들어, 하루 0부터 시작하는 ES 세포의 두 가지 일 치료를 위해 하루에 2 변조기를 씻으십시오. 더 이상 치료 48 시간보다 원하는 정지 시간이 지점까지 이틀 신선한 변조기와 보충 EB 미디어를 변경합니다.
  3. 일 6.25 후 현미경 EB 수축을 검사합니다. 각기 다른 치료 시간 코스 EBS를 계약의 비율을 얻기 위해서는 긍정적인 사람으로 EBS를 계약으로 우물을 점수.
  4. ES의 cardiogenesis에 대한 중요한 시간이 지점은 차량 제어에 비해 EBS는 신호 변조기에 의해 처리 계약의 높은 비율을 포함하는 시간 프레임입니다.

3. EBS에서 cardiogenesis에 대한 신호의 시간 창을 확인 매달려 방울로 만든

  1. 증발을 방지하기 위해 PBS의 3-4 ML로 추가하여 배양 접시를 준비합니다.
  2. 단계 1.1 ~ 1.5 2.5x10 4 셀 / ML 최종 세포 농도에서 ES 세포를 준비를 따르십시오.
  3. 쉽게 접근할 세균 그릇에 세포 혼합물을 붓고. 멀티채널 피펫을 사용하여 거꾸로 뚜껑에 20 μl 방울 (약 500 세포를 포함) 추가합니다. 개인 방울 연락하는 것을 허용하지 않습니다. 일반적으로 하나의 뚜껑 80 방울까지 들어갈 수 있습니다. PBS를 포함하는 요리를 통해 다시 뚜껑을 플립. 인큐베이터에서 EB 형성을 허용 24 시간 또는 48 시간 동안 부화.
  4. EB 미디어과 수영장 새로운 배양 접시에 EBS 2 뚜껑 3 ML 각 뚜껑에서 방울을 걸려에서 형성 EB를 씻으십시오. 10ml의 총 볼륨 EB 미디어를 추가합니다.
  5. 0.2 % 일 4 젤라틴 코팅 6 - 잘 접시에 정지에 전송 EBS. 일반적으로 30 EBS는 각 잘으로 전송됩니다. 각 잘에 대한 2 ML 최종 볼륨을 얻을 EB 미디어를 추가합니다.
  6. 96 - 웰 플레이트 실험에서 확인된 기간에 변조기 신호 품어.
  7. RT - PCR 추가, immunostaining 등, 필요한 경우의 특징 수 일 7 cardiogenesis 후 현미경 EB의 수축을 관찰.

Discussion

매달려 드롭 방식 EB 형성과 체외의 차별화에 사용되는 종래의 방법을하고 있습니다. 그러나, 그것은 힘드는이며 물류 문제로 인해 실험 유연성을 제한합니다. 실험자의 기술이 달린 방울로 성공 EB 형성 및 조작하는 데있어 매우 중요합니다 같은 토큰에 의해 결과도 확인이 더 어렵습니다. 간단한 방법은 단일 단계 과정으로 둥근 바닥 96 - 웰 플레이트에 EBS를 형성하는 것입니다. 이 포맷은 표준으로 체외 차별에 수 있으며 EB 형성 및 다운 스트림 조작 (예 : 변조기 추가 또는 제거)의 용이성으로 인해 더 많은 실험 조건을 수용할 수 있습니다. 또한, 96 - 웰 플레이트 형식은 마우스 ES 세포에서 효율적인 심사 도구로 최적화할 수 있습니다.

Disclosures

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

이 작품은 베테랑 어페어스와 NIH 보조금 5U01HL100398 및 1R01HL104040 지원했다.

Materials

Mouse CGR8 cells are mainly used.
ES medium: GMEM media supplemented with 10% heat-inactivated FBS, 2 mM L-glutamine, 0.05 mM 2-mercapt–thanol, and 200 U/ml murine LIF.
EB medium: Prepare IMDM media with 20% heat-inactivated FBS, 1.6 mM L-glutamine, 0.08 mM 2-mercapt–thanol, and 1X MEM Non-essential amino acid solution.

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References

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Cardiogenic 유도 효율을 Quantifying에 대한 수정 마우스 배아의 줄기 세포 기반 어세이
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Ao, A., Williams, C. H., Hao, J., Hong, C. C. Modified Mouse Embryonic Stem Cell based Assay for Quantifying Cardiogenic Induction Efficiency. J. Vis. Exp. (50), e2656, doi:10.3791/2656 (2011).More

Ao, A., Williams, C. H., Hao, J., Hong, C. C. Modified Mouse Embryonic Stem Cell based Assay for Quantifying Cardiogenic Induction Efficiency. J. Vis. Exp. (50), e2656, doi:10.3791/2656 (2011).

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