Summary
نحن تصف استخدام خلية مقايسة الماوس ES يستند إلى تحديد النوافذ وقت حرج بالنسبة لcatenin - β Wnt / BMP وتفعيل إشارة قلبية خلال الاستقراء. الأسلوب يوفر منصة موحدة يحدد مقدار الكفاءة موثوق قلبية ، وأنه قابل للتطبيق لدراسة الأنساب خلية أخرى.
Abstract
وتخضع لرقابة صارمة من تمايز الخلايا الجذعية المحفزة عن طريق التنظيم الزماني والمكاني لمسارات رئيسية متعددة الإشارة. وقد كانت واحدة من العقبات التي تعترض سبيل فهمها أساليب متنوعة في ربط التغيرات في الأحداث الرئيسية يشير إلى كفاءة التمايز. نحن هنا وصف استخدام الماوس مقايسة الخلايا الجذعية الجنينية (ES) استنادا إلى تحديد وقت حرج بالنسبة لنوافذ catenin - β Wnt / BMP وتفعيل إشارة قلبية خلال الاستقراء. بتسجيله للتعاقد الهيئات الجنينية (EBS) في شكل لوحة 96 - جيدا ، يمكننا قياس كفاءة قلبية بسرعة وتحديد النوافذ وقت حاسم بالنسبة لcatenin - β Wnt / BMP وتفعيل دورة في إشارة الزمنية التالية المغير علاجات محددة. لا يقتصر الرئيسية الواردة هنا لتحريض القلب وحده ، ويمكن تطبيقها من أجل دراسة العديد من الأنساب خلية أخرى. بالإضافة إلى ذلك ، شكل 96 - جيدا لديه القدرة على مزيد من التطوير وإنتاجية عالية ، والفحص الآلي للسماح لاختبار الفرضيات التجريبية أكثر تعقيدا.
Protocol
1. الجنينية الجسم (EB) تشكيل القاع باستخدام 96 - الجولة أيضا لوحات microtiter
- زراعة خلايا ES الماوس في لوحات 10cm ثقافة الخلية مع خلية فأر المتوسطة ES تستكمل مع LIF.
- عندما الخلايا ES تكون جاهزة للاستخدام (عادة في نقطة التقاء ٪ 50-70) ، وإزالة وسائل الاعلام وفاق وشطف خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني العقيمة 5ml.
- إضافة 2ml 0.05 ٪ التربسين / EDTA لكل لوحة لوحات واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 3 5 دقائق ~ ، إرو التربسين EDTA مع وسائل الإعلام وفاق 3 مل.
- نقل الخلايا إلى أنابيب الصقر 50ml وتدور بسرعة 1000 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق.
- إزالة طاف ، وresuspend الخلية بيليه مع المبلغ المطلوب من وسائل الإعلام EB.
- حساب عدد الخلايا والخلايا لتمييع 5 خلايا X10 3 / مل في وسائل الإعلام EB.
- ماصة استخدام الأقنية لإضافة وسائل الإعلام 100μl EB تحتوي على خلايا في كل بئر من 96 -- جولة لوحات microtiter جيدا.
- المكان 96 -- جولة لوحات microtiter جيدا في حاضنة.
2. التعرف على النوافذ الوقت الحرج من مسار مفتاح يشير ل تخلق القلب
- إضافة جهري مسارات محددة للإشارات والتحكم في السيارة في كل بئر من لوحات microtiter 96 - جيدا تحتوي على خلايا ES عند نقاط زمنية مختلفة مثل اليوم 0 ، يوم 1 ، 2 اليوم ، يوم 3 و 4 أيام ، الخ نصف من الآبار في كل 96 كذلك ، تستخدم لوحة (48 بئرا) عن كل نقطة زمنية بدءا من العلاج.
- تغسل وجهري وسائل الاعلام عن طريق تغيير EB لكل 48 بئرا في مختلف نقاط وقف الوقت. على سبيل المثال ، للحصول على اثنين يوميا لعلاج الخلايا ES بدءا من اليوم 0 ، تغسل جهري في اليوم 2. أي علاج لمدة أطول من 48 ساعة ، وتغير وسائل الاعلام EB تستكمل مع جهري جديدة كل يومين حتى نقطة توقف الوقت المطلوب.
- دراسة انكماش EB تحت المجهر بعد اليوم 7. يسجل الآبار التعاقد مع EBS والإيجابية للحصول على النسب المئوية للمقاولات EBS لكل مقرر علاجي زمنية مختلفة.
- النقاط وقت حرج بالنسبة لتخلق القلب وفاق والأطر الزمنية التي تحتوي على أعلى نسبة من التعاقد EBS يعامل بها جهري يشير بالمقارنة مع السيطرة على السيارة.
3. جعل التحقق من النوافذ وقت يشير لتخلق القلب في EBS قطرات من الشنق
- إعداد أطباق بتري بإضافة 3-4 مل مع برنامج تلفزيوني لمنع التبخر.
- اتبع الخطوات من 1.1 ~ 1.5 لإعداد الخلايا في الخلايا ES 2.5x10 4 / مل كثافة الخلية النهائي.
- اسكبي الخليط في طبق الخلية البكتيرية ليسهل الوصول إليها. باستخدام ماصة متعددة ، إضافة 20 قطرات ميكرولتر (يحتوي على حوالي 500 الخلايا) على الجفن المقلوب. لا تسمح للقطرات الفردية للمس. عموما يمكن للمرء أن يصلح غطاء ما يصل الى 80 قطرات. غطاء الوجه الخلفي على صحن يحتوي على برنامج تلفزيوني. احتضان لمدة 24 ساعة أو 48 ساعة للسماح بتشكيل المجلس التنفيذي في حاضنة.
- غسل أسفل EB تشكلت من الشنق قطرات من كل غطاء مع 3 مل من وسائل الاعلام وحمام سباحة EB 2 من الأغطية الحديدية على طبق بيتري جديدة. إضافة إلى وسائل الإعلام EB إجمالي حجم 10ML.
- نقل EBS في التعليق على 0.2 ٪ الجيلاتين مغلفة جيدا 6 لوحات في اليوم 4. في عام 30 يتم نقلها إلى EBS كل بئر. إضافة الوسائط EB للحصول على حجم 2 مل النهائية لكل بئر.
- احتضان جهري يشير إلى الفترة الزمنية التي تم تحديدها من 96 لوحة تجارب جيدة.
- مراقبة انكماش EB تحت المجهر بعد يوم 7 و تخلق القلب يمكن وصفها بمزيد من immunostaining ، RT - PCR وغيرها ، وإذا لزم الأمر.
Discussion
وقد تم إسقاط الأسلوب شنقا في الطريقة التقليدية المستخدمة لتشكيل المجلس التنفيذي والتمايز في المختبر. ومع ذلك ، فإنه أمر شاق وحدود المرونة التجريبية بسبب المخاوف اللوجيستية. وعلى نفس المنوال ، والنتائج هي أيضا أكثر صعوبة التحقق من صحة مثل مهارة المجرب أمر حاسم لتشكيل المجلس التنفيذي الناجح والتلاعب وقطرات شنقا. وأبسط طريقة لشكل EBS في صفيحة مستديرة القاع 96 وكذلك في عملية واحدة خطوة. يسمح هذا التنسيق في المختبر لتمايز تكون موحدة ، ويمكن أن تستوعب أكثر الظروف التجريبية نظرا لسهولة تشكيل المجلس التنفيذي والتلاعب المصب (مثل إضافة أو إزالة المغير). وعلاوة على ذلك ، يمكن أن يكون الأمثل لل96 - جيدا شكل لوحة لتكون أداة فعالة في فحص خلايا ES الماوس.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة وشؤون المحاربين القدامى والمنح 5U01HL100398 1R01HL104040.
Materials
| Mouse CGR8 cells are mainly used. | |||
| ES medium: GMEM media supplemented with 10% heat-inactivated FBS, 2 mM L-glutamine, 0.05 mM 2-mercapt–thanol, and 200 U/ml murine LIF. | |||
| EB medium: Prepare IMDM media with 20% heat-inactivated FBS, 1.6 mM L-glutamine, 0.08 mM 2-mercapt–thanol, and 1X MEM Non-essential amino acid solution. |
References
- Fukuda, K., Yuasa, S. Stem cells as a source of regenerative cardiomyocytes. Circulation research. 98, 1002-1013 (2006).
- Foley, A. C., Mercola, M. Heart induction by Wnt antagonists depends on the homeodomain transcription factor Hex. Genes Dev. 19, 387-396 (2005).
- Naito, A. T., Shiojima, I., Akazawa, H., Hidaka, K., Morisaki, T., Kikuchi, A., Komuro, I. Developmental stage-specific biphasic roles of Wnt/beta-catenin signaling in cardiomyogenesis and hematopoiesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19812-19817 (2006).
- Hao, J., Daleo, M. A., Murphy, C. K., Yu, P. B., Ho, J. N., Hu, J., Peterson, R. T., Hatzopoulos, A. K., Hong, C. C. Dorsomorphin, a selective small molecule inhibitor of BMP signaling, promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells. PloS one. 3, e2904-e2904 (2008).
