Vi beskriver användningen av en mus ES-cell-baserad analys för att identifiera kritiska tidsfönster för Wnt / β-catenin och BMP signalen ljuder vid kardiogen induktion. Metoden ger en standardiserad plattform som tillförlitligt kvantifierar kardiogen effektivitet, och det är som gäller för studiet av andra cell linjer.
Differentiering av pluripotenta stamceller är hårt styrt av tid och rum reglering av flera viktiga signalvägar. Ett av hindren för dess förståelse har varit varierande metoder korrelera förändringar av viktiga signalsystem händelser till differentiering effektivitet. Vi beskriver här att använda en mus embryonala stamceller (ES) cell-baserad analys för att identifiera kritiska tidsfönster för Wnt / β-catenin och BMP signalen ljuder vid kardiogen induktion. Genom poängsättning för upphandlande embryonala organ (EBS) i en 96-brunnar format, kan vi kvantifiera snabbt kardiogen effektiviteten och identifiera avgörande tidsfönster för Wnt / β-catenin och BMP signalen ljuder under en tidsperiod efter specifika modulatorn behandlingar. De viktigaste beskrivs här är inte begränsad till hjärt induktion ensam, och kan användas mot studiet av många andra cell linjer. Dessutom har 96-bra format potential att vidareutvecklas som en hög genomströmning, automatiserad analys för att möjliggöra testning av mer sofistikerade experimentella hypoteser.
Den droppe Metoden har den konventionella metod som används för EB bildning och in vitro-differentiering. Men det är mödosamt och begränsar experimentella flexibilitet på grund av logistiska problem. På samma sätt, resultaten är också svårare att validera som förmågan att försöksledaren är avgörande för framgångsrika EB bildning och manipulation som hängande droppar. En enklare metod är att bilda strandsandaler en rund botten 96-brunnar som ett enda steg. Detta format möjliggör in vitro differentiering vara standardiserade och kan rymma mer experimentella förhållanden på grund av den enkla EB bildning och nedströms manipulation (t.ex. modulator tillägg eller borttagande). Dessutom kan 96-brunnar format optimeras för att vara ett effektivt verktyg för screening i mus ES-celler.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Veterans Affairs och NIH bidrag 5U01HL100398 och 1R01HL104040.