Summary
Цитотоксичности для измерения естественных киллеров ячейки литической борьбе с ВИЧ-инфицированные клетки ограничена чистотой клеток-мишеней. Мы демонстрируем здесь изоляции высокой степени очистки населения ВИЧ-1-инфицированных первичных Т-клеточных взрывов, воспользовавшись способностью ВИЧ-1 с до нижнего модулировать CD4.
Protocol
1. Изоляция по правам CD4 + Т-клеток из периферической крови (см. рисунок 1)
- Периферической венозной крови (от 40 до 60 мл) собирается в Vacutainer Трубки, содержащие гепарин натрия (Becton Дикенсон).
- Периферической крови, затем переведен из Vacutainer Трубы до 50 мл конические пробирки полистирола (20 мл крови в трубку).
- RosetteSep CD4 + T-Cell изоляции реагента (StemCell технологий) добавляется в 1 мл объемом не более 20 мл крови в 50 мл трубки и хорошо перемешивают.
- Затем смесь выдерживают при температуре 20-25 ° С в течение 20 минут.
- Через 20 минут, кальция и магния, свободного (CMF) фосфатным буферным раствором [PBS (Hyclone] л / 2% тепла инактивированной (56 ° С в течение 30 минут) эмбриональной телячьей сыворотки [FBS (Hyclone)] добавляется к смеси Для достижения конечного объема 40 мл.
- Разбавленной смеси (30 мл), затем слой поверх 15 мл лимфоцитов Средний Разделение [LSM (Cellgro)] в 50 мл свежего полистирола конических труб.
- 50 мл трубы затем центрифугировали при 1200 х г в течение 20 минут с вынул.
- 50 мл трубы удаляют из центрифуги осторожно, чтобы взаимодействие между МНК и среднего не нарушается. Клетки на границе собраны с 10 мл пипеткой и помещали в 50 мл свежего полистирола конических труб.
- Собрал интерфейсы разбавляют PBS т / 2% ЭТС до конечного объема 50 мл.
- 50 мл пробирки с разбавленным интерфейсы центрифугировали при 1200 х г в течение 10 минут с тормозом.
- После центрифугирования супернатанты наддува и гранулы ресуспендировали в 10 мл PBS т / 2% ЭТС.
- Клеточные суспензии, которые затем объединяются в один 50 мл коническую трубку и разбавляют до 50 мл PBS с ж / 2% FBS.
- Трубка, содержащая сводный клеточной суспензии центрифугируют при 300 х г в течение 10 минут, чтобы удалить все оставшиеся LSM.
- Супернатант отсасывают и гранулы затем ресуспендировали в 10 мл RPMI-1640 (Hyclone), содержащей 10% FBS, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина (Hyclone) и 2 мМ L-глутамина (CellGro ) (RPMI-полно) и подсчитывали использованием гемоцитометра.
- Концентрация очищенного CD4 + Т-клеток доводят до 3х10 6 / мл RPMI-полной.
- CD4 + 'с, затем стимулировали путем культивирования их anti-CD3/anti-CD28 связан с бисером [T-Cell Expansion Kit (Miltenyi Biotec)] на три бусины на ячейку отношения в течение 72 часов при 37 ° С в 5% С0 2 увлажненный инкубатора.
2. Заражение CD4 + Т-клеток с ВИЧ-1 (см. рисунок 1)
- Сотовые суспензии, содержащей стимулировали CD4 + T-клетки, удаляются из культуры пластины и рассчитывал использованием гемоцитометра.
- CD4 + T-клеток (~ 2x10 6) добавляют в 15 мл коническую трубку для использования в качестве неинфицированных контроля.
- Остальная часть CD4 + T-клеточной суспензии помещают в 50 мл коническую трубку для инфекции.
- Пробирки, содержащие CD4 + Т-клеточные суспензии центрифугируют при 300 х г в течение 10 минут и супернатант культуры всасывается.
- Вынужденное CD4 + Т-клеток ресуспендируют непосредственно в культуре жидкости, содержащие вирусные частицы, а затем спин-инфицированных при 1200 х г в течение 2 часов при температуре 20-25 ° C 9. Обычно мы инфицировать CD4 + Т-клеток при множественности заражения (МВД) от 5 для репликации дефицитный штамм ВИЧ (например, DHIV-3) или МВД 0,01 для репликации компетентным вирусом (например, ВИЧ-1 NL4 / 3) . Конечный объем не имеет значения, но трубы должны быть сбалансированы для центрифугирования. Polybrene (Santa Cruz) добавляется в культуральной жидкости до spinfection в конечной концентрации 10 мкг / мл.
- После завершения spinfection, супернатанты удаляют и клетки ресуспендировали при плотности клеток 3х10 6 / мл в RPMI-полной дополнен 100 ЕД / мл ИЛ-2. Инфицированных и неинфицированных клетках культуры в течение 72 часов, если репликация вируса некомпетентных была использована для заражения клетки или 5-7 дней, если репликация вируса компетентных была использована для заражения клетки. СМИ следует менять каждые 48 часов, в течение культуре.
3. Изоляция по правам естественных клеток-киллеров из периферической крови
- Периферической венозной крови (~ 100 мл) собирается из того же донора используется для изоляции CD4 + Т-клеток в Vacutainer Трубки, содержащие гепарин натрия (Becton Дикенсон).
- Затем кровь передается от Vacutainer Трубы в 50 мл конические пробирки в 20 мл аликвоты.
- Vacutainer Трубы затем промывают 8 мл CMF Хэнкс сбалансированном солевом растворе [HBSS (Hyclone)] и моет переданы 50 мл conicals containiнг 20 мл периферической крови. В результате объем в каждой 50 мл коническую составляет 35 мл.
- Разбавленной крови, затем слой поверх 15 мл LSM в свежем 50 мл коническую трубку и труб центрифугировали при 400 х г в течение 30 минут с вынул.
- Трубы осторожно удаляют из центрифуги и в результате взаимодействия между МНК и среднего собирают из каждой пробирки с использованием 10 мл пипеткой и помещали в 50 мл свежего конических труб.
- Клеточные суспензии, которые один раз промывали CMF HBSS (центрифугировали при 400 х г в течение 15 минут с тормозом).
- После первой стирки супернатанты удаляются, и в результате гранулы объединены в единый 50 мл конические и дважды промывают HBSS CMF (центрифугировали при 30 х г в течение 10 минут с тормозом), чтобы удалить все оставшиеся LSM.
- После последнего вымыть осадок resupended в 10 мл буфера для лизиса ACK (150 мМ NH 4 Cl, 1,0 мМ KHCO 3 и 0,1 мМ ЭДТА рН 7,3) и инкубировали при комнатной температуре (20-25 ° С) в течение 5 минут. Этот шаг необходим для того, чтобы удалить загрязнения эритроцитов из мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК).
- Через 10 мин. 40 мл PBS CMF добавляется к клеточной суспензии для того, чтобы остановить лизис реакции.
- Трубки с клеточной суспензии содержащей РВМС и лизированных эритроцитов затем центрифугировали при 300 х г в течение 10 минут с тормозом.
- Супернатант удаляют, а осадок ресуспендируют в 5 мл PBS с 2% ЭТС и 2 мМ EDTA и подсчитывали использованием гемоцитометра.
- Естественных киллеров (NK) Затем клетки изолированы от РВМС использованием НК Kit изолятор [негативный отбор-человека (Miltenyi Biotec)] в соответствии с инструкциями производителя.
- Проточные от колонны собраны в 15 мл пробирки и трубы центрифугировали при 300 х г в течение 10 минут с тормозом.
- Супернатанты удаляются и гранулы ресуспендировали. Ресуспендировали гранулы объединены в одну трубку в общем объеме 1 мл среды Искова изменения Дульбеко [IMDM (Gibco)] с добавлением 10% АВ + тепла инактивированной (56 ° С в течение 30 минут) сыворотки крови человека (ГС) и подсчитывали с hemacytometer.
- Объем клеточной суспензии регулируется с IMDM w/10% HS, так что конечная плотность НК клеток 3х10 6 / мл. Суспензии клеток делится пополам. Один набор натуральных киллеров получает 200 Ед / мл рекомбинантного человеческого интерлейкина-2. Другой набор клеток остается в среде без цитокинов лечения.
- NK клеточных культурах затем инкубировали в течение ночи при температуре 37 ° C, 5% СО 2
- В результате NK клетки затем использованы в качестве эффекторных клеток как для анализа CD107a дегрануляции или 51 Cr релиз анализа.
4. Очистка ВИЧ-1 инфицированных клеток (см. рисунок 1)
- Культуры жидкости, содержащие инфицированные клетки удаляются из пластин и центрифугировали при 300 х г в течение 10 минут с тормозом.
- Супернатант отсасывают и гранулы ресуспендировали в 2 мл ФСБ с 2% ЭТС и 2 мМ ЭДТА и клеток рассчитывали на гемоцитометра.
- Зараженные клетки, которые не содержат ВИЧ-1 являются изолированными от тех, которые укрывают вирус, воспользовавшись тем, что ВИЧ-1 модулирует вниз CD4. Для этой цели CD4 положительных Комплект изоляции (Invitrogen) используется в соответствии с инструкциями производителя, за исключением, что одна-CD4 бусину на ячейку отношение используется.
- При снятии CD4 + T-клетки, отмершие клетки удаляются из очищенной клеточной популяции укрывательство вирусов с помощью мертвого Kit Удаление Cell (Miltenyi Biotec) в соответствии с инструкциями производителя.
- Проточный следующие мертвых удаления ячейки в столбцах центрифугируют при 300 х г в течение 10 минут с тормозом. Супернатант удаляют, гранулы ресуспендировали в 1 мл RPMI-полной и ячейки учитываются.
- Очищенной инфицированных клеток в настоящее время готова к использованию в качестве мишеней в анализе CD107a дегрануляции или 51 Cr релиз анализа.
5. CD107a дегрануляции анализ (см. Рисунок 2)
- Культур НК ячейки удаляются из пластин и клеточной суспензии учитывается.
- Суспензий НК ячейки центрифугировали при 300 х г в течение 10 минут с тормозом.
- NK клетки ресуспендировали в RPMI-полной и окончательной концентрации доводят до 10 6 кл / мл.
- Суспензии клеток от изолированной инфицированных и неинфицированных Т-клеток, генерируемых в вышеупомянутые шаги центрифугируют при 300 х г в течение 10 минут с тормозом.
- Супернатанты удаляются и гранулы ресуспендировали в RPMI-полной в 2х10 6 кл / мл.
- К562 клетки используются как положительные клетки-мишени контроль, так как они очень восприимчивы к НК лизиса. Тон клетки центрифугировали при 300 х г в течение 10 минут с тормозом, супернатанты удаляются и гранулы ресуспендировали в RPMI-полной в 2х10 6 кл / мл
- В 96-V дном и пластины 100 ПДК цели и 100 мкл эффекторов добавляются в скважинах.
- Хорошо, содержащий 100 mcLof эффекторов и 100 мкл среды без клетки-мишени будет использоваться для неспецифической дегрануляции NK клеток.
- Для каждой лунки 10 mcLFITC-сопряженных анти-CD107a (BDIS) добавляется.
- Пластина затем центрифугировали при 20 х г в течение 2 минут с тормозом.
- Центрифугировали пластины инкубировали в течение 4 часов при 37 ° C и 5% СО 2.
- После инкубации пластина центрифугируют при 400 х г в течение 5 минут с тормозом.
- Супернатант удаляется из гранул.
- Каждая скважина затем окрашивали следующие панели флуорохромом конъюгированных антител на льду в течение 20 минут в общей сложности 100 mcLof потока буфера (PBS т / 2% ЭТС и 0,1% NaN 3)
- anti-CD3/14/20 [Pacific Blue-сопряженных (Biolegend)]
- анти-CD56 [APC (Biolegend)]
- После 20 минут инкубации, 200 мкл буфера потока добавляется в каждую лунку и пластину центрифугируют при 400 х г в течение 5 минут с тормозом.
- Потоком буфер затем тщательно атмосферный из каждой лунки, используя 2 мл аспирационной пипетки оснащен 200 кончик микропипеткой мкл, удостоверившись, чтобы не потревожить осадок.
- Шаг 15 и 16 повторяют еще раз.
- Пеллеты ресуспендировали в 200 мкл 1% параформальдегида в СЦМ PBS. Клеточные суспензии, затем переведен в потоке труб.
- Общий объем доводят до 300 мкл, добавив ~ 100 мкл 1% параформальдегида в СЦМ PBS в каждую пробирку.
- События (2х10 4), соответствующих натуральных киллеров собираются потока цитометр использованием FACS DIVA (BDIS) программное обеспечение для сбора и проанализированы с помощью потока Джо программное обеспечение (TreeStar).
6. CD107a Память стратегии (см. Рисунок 3)
- Одноместный ворота ячейки создаются с помощью вперед высота рассеяния (FSC-H) в зависимости от ширины разброса вперед (FSC-W) сюжета.
- Для участка размером в сравнении с зернистостью стороны ФСБ против рассеяния (SSC) сюжет создан на одном ворота клетки. Обычно лимфоциты обладают относительно низкой детализации и средних размеров ячейки.
- Клеток лимфоцитов ворот, затем нанесены на точку участок CD3/14/20 окрашенных клеток по сравнению с CD56 окрашенных клеток к воротам на NK клетки опуская моноцитов (CD14), Т-клетки (CD3) и В-клеток ( CD20).
- CD56 поз закрытого населения, то оценка для CD107a.
- NK клетки без групповых целей используется для установки ворот для того, что считается CD107a отрицательным.
7. 51 Cr выпуска анализ (см. рисунок 4)
- Зараженные клетки-мишени помечены 125 МТПП 51 Cr (Perkin Elmer) в saline/10 6 клеток в течение 2 часов в общей сложности 500 мкл при 37 ° С и 5% СО 2. В качестве положительного контроля 10 6 клеток К562 помечены 100 МТПП 51 Cr в течение 2 часов в общей сложности 500 мкл при 37 ° С и 5% СО 2. Общий объем доводят до 500 мкл с RPMI-полной. Объем 51 Cr добавлены к клеткам-мишеням рассчитывается здесь: (http://las.perkinelmer.com/Catalog/RadCalculator.htm?Mode=RadioactivityCalculator)
- Хотя клетками-мишенями являются маркировка, ранее изолированные NK клетки удаляются от культуры и подсчитаны. Клеточные культуры содержащих НК клетки центрифугировали при 300 х г в течение 10 минут с тормозами на.
- Гранулы содержащих НК клетки ресуспендировали в RPMI-полной и разбит на 3 трубы. Плотность клеток регулируется до 10 5 / мл в одной из труб 2.5x10 5 / мл во второй трубки и 5x10 5 / мл в третьей трубы.
- Маркированный цели клетки удаляются из инкубатора и 4,5 мл RPMI-полной добавляют в каждую пробирку. Трубы затем центрифугировали при 300 х GF или 10 минут.
- Супернатант сливают осторожно, чтобы не мешать гранул в контейнер для жидких радиоактивных отходов.
- Шаги 4 и 5 повторяются два раза больше, чтобы удалить все непоглощенной 51 Cr. Супернатанты с третьего мытья можно выбрасывать в контейнер для нерадиоактивных жидких отходов.
- Маркированный цели затем ресуспендировали в RPMI-полной, окончательной плотность клеток из 10 5 / мл.
- 100 мкл меченых цели аликвоты в лунки 96-у-дно и пластины для конечного числа ячейка 10 4 клетки-мишени / лунку.
- Table1 пример типичный вариант для 51 анализа выпуска Cr. Каждая группа будет сделано в трех экземплярах.
1 2 4 5 6 7 8 9 K562 E: T (1:1) K562 E: T (1:1) K562 E: T (1:1) K562 E: T (2,5:1) K562 E: T (2,5:1) K562 E: T (2,5:1) K562 E: T (5:1) K562 E: T (5:1) K562 E: T (5:1) B Пользовательский интерфейс E: T (1:1) Пользовательский интерфейс E: T (1:1) Пользовательский интерфейс E: T (1:1) Пользовательский интерфейс E: T (2,5:1) Пользовательский интерфейс E: T (2,5:1) Пользовательский интерфейс E: T (2,5:1) Пользовательский интерфейс E: T (5:1) Пользовательский интерфейс E: T (5:1) Пользовательский интерфейс E: T (5:1) C Инфицированных ВИЧ-1 E: T (1:1) Инфицированных ВИЧ-1 E: T (1:1) Инфицированных ВИЧ-1 E: T (1:1) Инфицированных ВИЧ-1 E: T (2,5:1) Инфицированных ВИЧ-1 E: T (2,5:1) Инфицированных ВИЧ-1 E: T (2,5:1) Инфицированных ВИЧ-1 E: T (1:1) Инфицированных ВИЧ-1 E: T (1:1) Инфицированных ВИЧ-1 E: T (1:1) D E F К562 спонтанного выделения К562 спонтанного выделения К562 спонтанного выделения Пользовательский интерфейс спонтанного выделения Пользовательский интерфейс спонтанного выделения Пользовательский интерфейс спонтанного выделения Инфицированных ВИЧ-1 Спонтанное выпуска Инфицированных ВИЧ-1 Спонтанное выпуска Инфицированных ВИЧ-1 Спонтанное выпуска G К562 Максимальный выпуска К562 Максимальный выпуска К562 Максимальный выпуска Пользовательский интерфейс Максимальная выпуска Пользовательский интерфейс Максимальная выпуска Пользовательский интерфейс Максимальная выпуска Инфицированных ВИЧ-1 выпуска Maxmum Инфицированных ВИЧ-1 выпуска Maxmum Инфицированных ВИЧ-1 выпуска Maxmum - 100 ПДК выше NK клеточные суспензии добавляют в каждую лунку содержащие клетки-мишени.
- 100 мкл цели будут добавлены в соответствующие лунки, в которых эффекторные клетки отсутствуют для максимальной и спонтанные группы релизе. Спонтанные группы релиз инкубируют с дополнительно 100 мкл RPMI-полной.
- 96-луночного планшета центрифугируют при 20 х г в течение 2 минут с тормозом.
- Центрифугировали пластина затем инкубируют при 37 ° С и 5% CO 2 в течение 4 часов.
- После 4-часовой инкубации 5 ПДК 1:10 разбавление эритроциты человека в RPMI-полной добавляется в каждую лунку, кроме максимального скважин релизе.
- 100 мкл 10% додецилсульфата натрия добавляется к максимальной скважин релизе.
- Пластины центрифугируют при 400 х г в течение 5 минут, чтобы гранулы клеток.
- 100 мкл бесклеточной супернатант собирают из каждой лунки и помещены в отдельный гамма-счетчик труб (Perkin Elmer). Трубы помещаются в 2470 Автоматический счетчик Gamma (Perkin Elmer). Размере 51 Cr, присутствующих в культуральной жидкости измеряется как импульсов в минуту от среднего показателя 2-х минутах чтения.
- Графы в минуту (CPM) показания образцов и контролей используются для расчета конкретных% лизиса, используя следующее уравнение:
[(Экспериментальная CPM - средняя цена за тысячу показов спонтанной) / (средняя максимальная цена за тысячу показов - CPM означает спонтанное)] х 100
8. Представитель Результаты:
Рисунок 1. Шаги, участвующих в изоляции естественных клеток-киллеров и поколения ВИЧ-1-инфицированных клеток-мишеней из периферической крови.
Рисунок 2. Шаги, участвующих в строительстве анализа CD107a дегрануляции NK использованием клеток эффекторов и клеток К562, неинфицированным CD4 + Т-клеток и инфицированных ВИЧ-1 Т-клеток в качестве мишеней.
Рисунок 3. Проточная цитометрия-литниковой стратегии анализа дегрануляции CD107a. () Память на отдельные клетки и исключая скопления или дублеты на участке FSC-(вперед площадь разброса) против FSC-H (вперед высота разброс). (B) Одноместный ворота клетка на графике как FSC-против SSC (сторона разброс) литниковой на популяции лимфоцитов. (C) лимфоцитов ворот на графике как CD3/14/20(Т-клеток, моноцитов, В-клетки) против CD56 (NK клеток), стробирование по CD56 поз andCD3/14/20 нег населения (НК ворота). (D) Н. К. ворот на графике как CD107a против CD56 для визуализации NK клеток, которые degranulated (CD107a POS).
Рисунок 4. Шаги, участвующих в строительстве 51 Cr релиз анализа использования NK клеток эффекторов и клеток К562, неинфицированным CD4 + Т-клеток и инфицированных ВИЧ-1 Т-клеток в качестве мишеней.
Рисунок 5. Представитель результатов оценки цитотоксической реакции естественных киллеров против ВИЧ-1-инфицированных клеток. (А) НК-клеток оценивали по их способности дегрануляции без цели и в ответ на К562 элементов, первичных CD4 + Т-клеток и ВИЧ-инфицированных первичных Т-клеток по оценке процент NK-клеток, экспрессирующих поверхности CD107a. Номеров в каждом квадранте представляют процент от общего числа NK клеток. Б) НК-клетками оцениваются по их способности лизировать клеток К562, неинфицированным CD4 + Т-клеток и ВИЧ-1-инфицированных Т-клеток в 51 Анализ выпуска Cr при различных эффекторных ячейки клетки-мишени соотношения (E: T).
Discussion
Если все сделано правильно анализы, описанные в этом протоколе должны обеспечить репрезентативную картину НК способность клетки к дегрануляции против и лизиса инфицированных ВИЧ-1 клеток (см. рисунок 5). НК ячейки дегрануляции в ответ на ВИЧ-инфицированные клетки и НК лизис клетки ВИЧ-инфицированные клетки должно быть прямо пропорционально 10. Надежные результаты для двух НК ячейки функциональные тесты для измерения цитотоксических по борьбе с ВИЧ-инфицированные клетки зависят от изоляции высокой степени очистки НК клеток, а также высокой степени очистки населению зараженных клеток. Очистив НК-клеток и ВИЧ-1 инфицированных клеток имеют решающее значение для достижения довольно точно эффектора для клетки-мишени отношение. Кроме того, удаление омертвевших и апоптоза клеток из популяции клеток-мишеней важно до 51 Cr маркировки или инкубации с эффекторных клеток. 51 Cr могут быть усвоены клеток, которые подвергаются апоптозу, как наличие мертвых или апоптоза клеток при шаге маркировки изотопа приведет к высокой спонтанной релиза и будет искажать рассчитывается% конкретным лизиса. Более того, наличие мертвых или апоптоза клеток может вызвать НК дегрануляции клетка в результате аномально высоким уровнем экспрессии CD107a. Точные пипетки необходимо при удалении бесклеточной супернатанты следующие инкубации NK клеток и клеток-мишеней в 51 анализах Cr релиза, а различия в объеме супернатант удален из каждой параллельной также приведет к высокой стандартных отклонений. Изменения могут быть сделаны к этим протоколам оценить роль специфических рецепторов NK в запуске НК лизис клетки ВИЧ-инфицированных клеток путем инкубации эффекторов или цели до принятия совместного культуры с антагонистическими антител со специфическими рецепторами или лигандами 6,11. Цитокинов обработанных NK клеток (например, IL-2, Ил-15) могут быть использованы для оценки функциональности вынужденного киллеров 12. Кроме того, антитела зависимой цитотоксичности ячейки анализы могут быть выполнены с использованием этих протоколов. Анти-ВИЧ-антитела (например, анти-gp120) могут быть добавлены к клеткам-мишеням для признания НК ячейки низким сродством Fc рецептор CD16 13. Эти анализы, хотя и созданы для измерения НК ячейки цитотоксических по борьбе с ВИЧ-инфицированные клетки, также могут быть изменены, чтобы оценить возможности NK клеток продуцировать цитокины следующие ВИЧ-инфицированной клетки признание. Хотя мы описали в этом протоколе использование в пробирке инфицированные клетки, как клетки-мишени, мы недавно описал поколения клеток-мишеней у пациентов, инфицированных ВИЧ. Это требует изоляции CD4 + Т-клеток, затем расширение клеток в течение двух недель после стимуляции с митогены в присутствии интерлейкина-2 11. После двухнедельного периода расширения, протоколы, описанные в этой статье, используются для изоляции клеток-мишеней.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vaccutainer Tubes (Sodium Heparin) | BD Biosciences | 367874 | |
| RosetteSep CD4+ T-cell Isolation Kit | Stem Cell Technologies | 15062 | |
| CMF PBS | Hyclone | SH30256.01 | |
| FBS | Hyclone | 10437-028 | |
| Lymphocyte Separation Medium | Cellgro | 25-072-CV | |
| RPMI-1640 | Hyclone | SH30096.01 | |
| Penicillin / Streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-Cl | |
| T-cell Expansion Kit | Miltenyi Biotec | 130-091-441 | |
| CMF HBSS (1x) | Hyclone | SH30588.01 | |
| 0.5M EDTA | 46-034-Cl | ||
| NK Cell Negative Isolation Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-657 | |
| IMDM | GIBCO, by Life Technologies | 12440-046 | |
| CD4+ Positive Isolation Kit | Invitrogen | 113.31D | |
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| Polybrene | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-134220 | |
| CD3 PacificBlue | BD Biosciences | 558117 | |
| CD14 PacificBlue | Biolegend | 325616 | |
| CD20 PacificBlue | Biolegend | 302328 | |
| CD56 APC | Biolegend | 318310 | |
| CD69 PE | BD Biosciences | 555531 | |
| CD107a FITC | BD Biosciences | 555800 | |
| 51Chromium | PerkinElmer, Inc. | NEZ030002MC | |
| Gamma Counter Tubes | PerkinElmer, Inc. | 1270-401 | |
| 2470 Automatic Gamma Counter | PerkinElmer, Inc. | 2470-0050 | |
| FACS Diva | BD Biosciences | 643629 | |
| FlowJo | Tree Star, Inc. | FJ-9-1YR |
References
- Ruscetti, F. W. Analysis of effector mechanisms against HTLV-I- and HTLV-III/LAV-infected lymphoid cells. J Immunol. 136, 3619-3624 (1986).
- Zheng, Z. Y., Zucker-Franklin, D. Apparent ineffectiveness of natural killer cells vis-a-vis retrovirus-infected targets. J Immunol. 148, 3679-3685 (1992).
- Ferrari, G. Clade B-based HIV-1 vaccines elicit cross-clade cytotoxic T lymphocyte reactivities in uninfected volunteers. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 1396-1401 (1997).
- Shankar, P. Impaired function of circulating HIV-specific CD8(+) T cells in chronic human immunodeficiency virus infection. Blood. 96, 3094-3101 (2000).
- Ward, J. HIV-1 Vpr triggers natural killer cell-mediated lysis of infected cells through activation of the ATR-mediated DNA damage response. PLoS Pathog. 5, e1000613-e1000613 (2009).
- Ward, J. HIV modulates the expression of ligands important in triggering natural killer cell cytotoxic responses on infected primary T-cell blasts. Blood. 110, 1207-1214 (2007).
- Bonaparte, M. I., Barker, E. Killing of human immunodeficiency virus-infected primary T-cell blasts by autologous natural killer cells is dependent on the ability of the virus to alter the expression of major histocompatibility complex class I molecules. Blood. 104, 2087-2094 (2004).
- Stinchcombe, J. C., Griffiths, G. M. Secretory mechanisms in cell-mediated cytotoxicity. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 495-517 (2007).
- O'Doherty, U., Swiggard, W. J., Malim, M. H. Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding. J Virol. 74, 10074-10080 (2000).
- Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J Immunol Methods. 294, 15-22 (2004).
- Fogli, M. Lysis of endogenously infected CD4+ T cell blasts by rIL-2 activated autologous natural killer cells from HIV-infected viremic individuals. PLoS Pathog. 4, e1000101-e1000101 (2008).
- Tomescu, C., Chehimi, J., Maino, V. C., Montaner, L. J. NK cell lysis of HIV-1-infected autologous CD4 primary T cells: requirement for IFN-mediated NK activation by plasmacytoid dendritic cells. J Immunol. 179, 2097-2104 (2007).
- Ward, J. P., Bonaparte, M. I., Barker, E. HLA-C and HLA-E reduce antibody-dependent natural killer cell-mediated cytotoxicity of HIV-infected primary T cell blasts. Aids. 18, 1769-1779 (2004).
