Dissection et l'imagerie de zones actives dans le Drosophile Jonction neuromusculaire

Summary

La jonction neuromusculaire (JNM) de

Abstract

La drosophile larves jonction neuromusculaire (JNM) est un excellent modèle pour l'étude de la structure synaptique et la fonction. Drosophile est bien connue pour la facilité de puissantes manipulations génétiques et le système nerveux des larves s'est révélée particulièrement utile pour étudier non seulement la fonction normale, mais aussi des perturbations qui accompagnent certaines maladies neurologiques (Lloyd et Taylor, 2010). Bon nombre des principaux molécules synaptiques trouvés chez la drosophile sont également présents chez les mammifères et comme la plupart des synapses excitatrices du système nerveux central chez les mammifères, la drosophile est JNM glutamatergique et démontre dépendant de l'activité de remodelage (Koh et al., 2000). En outre, les neurones de drosophile peuvent être identifiés individuellement, car leurs habitudes innervation sont stéréotypés et répétitifs permettant d'étude a identifié terminaisons synaptiques, telles que celles entre les motoneurones et les fibres musculaires du corps-mur qu'ils innervent (Keshishian et Kim, 2004). L'existence de composants synapse évolutivement conservés avec la facilité de la manipulation génétique et physique rendre le modèle idéal pour étudier la drosophile mécanismes sous-jacents de la fonction synaptique (Budnik, 1996).

Les zones actives à terminaisons synaptiques sont d'un intérêt particulier parce que ce sont les sites de la libération des neurotransmetteurs. NC82 est un anticorps monoclonal qui reconnaît la drosophile la protéine Bruchpilot (BRP), une membre de la famille CAST1/ERC qui est un élément important de la zone active (Wagh et al., 2006). BRP a montré d'adapter directement la zone active T-bar et est responsable de regroupement efficace canaux Ca ^{2 +} sous la barre en T de densité (Fouquet et al., 2009). Mutants de BRP ont réduit de Ca ^{2 +} densité de canaux, déprimé communiqué vésicules évoqués, et modifié à court terme de plasticité (Kittel et al., 2006). Modifications aux zones actives ont été observées dans les modèles de la maladie chez la drosophile. Par exemple, l'immunofluorescence utilisant l'anticorps NC82 a montré que la densité de la zone active a diminué dans les modèles de la sclérose latérale amyotrophique et Pitt-Hopkins syndrome (Ratnaparkhi et al, 2008;. Zweier et al, 2009).. Ainsi, l'évaluation des zones actives, ou d'autres protéines synaptiques, dans les modèles de larves de drosophile de la maladie peut fournir un indice précieux initiale à la présence d'un défaut synaptique.

Préparer l'ensemble de montage des larves de drosophile disséquées pour l'analyse par immunofluorescence de l'JNM exige une certaine habileté, mais qui peut être accompli par la plupart des scientifiques avec un peu de pratique. Présenté est une méthode qui permet aux larves de plusieurs à être disséqués et immunocolorés dans le plat même dissection, limitant les différences environnementales entre chaque génotype et en fournissant suffisamment d'animaux pour la confiance dans la reproductibilité et l'analyse statistique.

Protocol

1. Préparation pour immunofluorescence:

1. Pour créer une surface de dissection, versez Sylgard 184 base élastomère de silicone dans une plaque de culture de tissus de petite taille. Assurez-vous de ne pas remplir complètement la plaque afin que la zone de dissection est inférieure à la jante.
2. Garniture broches de dissection d'une longueur d'environ 3,5 mm pour une plus grande facilité de manipulation, et assurez-vous d'avoir au moins 6 broches par larve.
3. Vous aurez besoin d'une pince émoussé qui vous permettra de vous saisir des broches pour la dissection.

2. Dissection des larves:

1. Sélectionnez errance troisième stade larvaire qui grouille autour des côtés de la fiole et n'ont pas commencé à se nymphoser.
2. Placez une larve à la surface dissection sous une loupe binoculaire. Évacuer l'excès humide en utilisant un Kimwipe.
3. Disposez chaque larve de telle sorte que la face dorsale vers le haut. Vous serez en mesure de voir deux trachée, des lignes blanches le long de la face dorsale de la larve. Essayez de centre de ceux-ci dans le milieu autant que possible, car cela marque la ligne médiane dorsale.
4. # 1 pin lieu juste au-dessus des crochets buccaux (figure 1).
5. Placez la broche N ° 2 dans la queue juste au-dessus les stigmates entre les trachées.
6. Ajoutez une petite quantité de PBS aux larves pour éviter le dessèchement de la cuticule.
7. Répétez les étapes ci-dessus avec toutes les larves, en s'assurant que les génotypes sont séparés spatialement en plaçant une épingle entre chaque génotype.
8. Faites une petite coupe transversale à droite ci-dessus broche N ° 2 sur les deux trachées (figure 1).
9. Insérez vos ciseaux dans la première coupe et couper le long de la ligne médiane dorsale entre les trachées tout le chemin jusqu'à broches passé # 1.
10. Vous aurez besoin de faire d'autres petites coupures dans le bas tout en haut et de chaque côté de la cuticule, de sorte que les côtés gauche et droit seront ouverts jusqu'à vous permettant de les épingler sans tirer sur la cuticule.
11. Placez la broche # 's 3, 4, 5, et 6 à chaque coin.
12. Fixer l'échantillon avec 4% PFA pendant 20-25 minutes à température ambiante
13. Décanter le PFA et rincer à l'époque du PBS 3-4, décantation à chaque fois.

3. Prélèvement de tissus:

1. Commencez par enlever les tissus à l'extrémité postérieure, car généralement vous voulez protéger la zone où le cerveau se trouve.
2. Tout en utilisant un steromicroscope et avec les larves dans une goutte de PBS, d'abord saisir l'extrémité postérieure de l'un de la trachée et tirez-ce qui peut éliminer une partie des graisses corporelles avec elle. Répétez l'opération pour la trachée secondes.
3. Prenez un peu postérieure du corps gras ou intestin et les sortir de la préparation. Une fois que la plupart des tissus postérieure a été enlevée, viser à supprimer les tissus petits autour du cerveau. Si vous êtes uniquement intéressé par les muscles, ou la morphologie de la JNM vous pouvez enlever le cerveau aussi.
4. Retrait du cerveau permet de mieux visualiser Muscle 31, qui est un marqueur utile pour l'orientation du segment abdominal.

4. Immunofluorescence pour les zones actives:

1. Ajouter un agent bloquant (5% sérum de chèvre normal dans du PBS) à l'preps disséqué dans le plat de dissection. Bloc pour 1 heure à température ambiante. Si vous souhaitez faire une seule solution pour le blocage et d'anticorps dilutions, notamment 0,1% TritonX-100 à votre agent de blocage pour la perméabilisation des tissus.
2. Appliquer l'anticorps primaire dilué dans le réactif de blocage avec 0,1% TritonX-100. L'anticorps zone active est réalisable à travers le développement de la Banque études hybridomes (DSHB, http://dshb.biology.uiowa.edu/). Utilisez un anticorps de référence (par exemple la peroxydase de raifort conjugué Cy3) à l'étiquette de la membrane NMJ et des axones.
3. Incuber les anticorps primaires à 4 ° C pendant la nuit. Alors que la sécheresse du réfrigérateur ne s'évapore pas la solution d'anticorps, de créer une chambre d'humidité en mettant un peu d'eau dans le fond d'une boîte pointe de la pipette utilisée. Couvrir le couvercle translucide avec du papier d'aluminium afin de réduire fluorescentes blanchiment. Placer la lame de dissection dans la chambre d'humidité et de mettre toute la boîte dans l'incubateur de 4 ° C la nuit.
4. Le lendemain matin, laver avec du PBST (PBS avec 0,2% de Triton-X-100) 5-10 fois pendant 5-10 minutes chacun.
5. Incuber avec l'anticorps secondaire (par exemple, Invitrogen Alexa chèvre anti-souris-488) dilué dans le réactif de blocage avec 0,1% TritonX-100 à la température ambiante pendant 2-4 heures dans la chambre humide couverte. Inclure une tache nucléaire (par exemple DAPI) dans le secondaire, si vous souhaitez identifier l'emplacement du noyau dans les muscles ou le cerveau.
6. Laver avec du PBST (PBS avec 0,02% de Triton-X-100) 5-10 fois pendant 5-10 minutes chacun.

5. Montage du échantillons de larves sur des diapositives:

1. Décanter et la mèche hors du lavage PBST dernier.
2. Pipeter 1ml de glycérol d'environ 80% pour couvrir les peaux épinglé larvaire.
3. Retirer 5 des 6 broches dans toutes les larves.
4. Lorsque vous êtes prêt à mettre le génotype d'abord sur une diapositive enlever la goupille dernière pour toutes les larves de cette genotype.
5. Préparer un "lavage" slide en mettant deux gouttes de votre milieu de montage sur une lame propre. Cette étape est importante pour laver la solution d'eau hors des larves pour le montage et claire l'imagerie.
6. Prenez une larve par la queue avec votre pince émoussée, faites glisser la larve autour de la glycérine et ensuite le long des bords secs de votre plat de dissection, pour enlever la majorité de la glycérine. Placer les larves dans la chute de milieu de montage en premier.
7. Répétez l'étape 6 pour toutes les larves de la même génotype.
8. Une fois que toutes les larves sont dans la chute de milieu de montage d'abord, prenez la première larve par la queue et tirer à travers la baisse et ensuite le long des bords du plat à sec pour enlever la majorité de la moyenne. Ensuite, placez les larves dans la chute de milieu de montage secondes.
9. Répétez l'étape 8 pour toutes les larves ayant le même génotype.
10. Préparez votre dernière diapositive en l'étiquetage et de placer un petit "T" du milieu de montage sur la lame.
11. Comme dans l'étape 5.8, prenez la larve par la queue; tirez la peau grâce à la baisse le milieu de montage secondes et ensuite le long des côtés sèches du "Wash" diapositive. Après la majorité du milieu est venu éteint, placez la peau des larves sur la lame finale dans le milieu de montage.
12. Répétez l'opération pour toutes les peaux de larves.
13. Assurez-vous que toutes les peaux de larves sont disposées comme vous le souhaitez en vous assurant que le côté cuticule est bas et le muscle exposée est orientée vers le haut.
14. Placer une lamelle sur la lame afin de couvrir les larves disséqué, avec le bord à partir de la ligne supérieure de l'indicateur "T."
15. Mettez un petit poids (par exemple pile de 9 volts) sur la lamelle, en s'assurant que le milieu de montage s'étend entièrement sous la lamelle.
16. Afin de réduire possibles extinction de fluorescence, placer la lame dans un tiroir ou un espace sombre jusqu'à ce que le milieu de montage a guéri.
17. Nettoyer le support de montage qui débordait du tranchant de la lamelle. Nettoyer l'excès demi-sec de montage sur la lamelle ou une diapositive à l'éthanol 70%.
18. Pour créer un sceau final, sceller avec du vernis à ongles.

6. Les résultats représentatifs:

Un exemple de glisser des larves disséquées et immunocolorés est montré dans la figure 2. Lorsque les dissections des larves, des taches, et le montage sont réalisés correctement, l'utilisateur peut identifier le muscle larves d'intérêt (figure 3) dans les segments de A2-A6. Hoang et al. Fournit une description détaillée de la position des muscles ainsi que la caractérisation des boutons synaptiques spécifiques (Hoang et Chiba, 2001). En utilisant un objectif de forte puissance, l'utilisateur peut se concentrer sur une seule synapse et de prendre z-stack image. Une image de projection maximale représentant d'une partie de la synapse 6 / 7 est montré (figure 4). Ensuite, en utilisant un logiciel d'imagerie, les zones actives peuvent être quantitativement évalué les caractéristiques qui sont particulières à votre phénotype mutant. Exemples de fonctionnalités qui peuvent être modifiées dans un phénotype particulier mutant comprennent le nombre total, l'intensité de fluorescence, et l'espacement entre les zones actives.

Pièges potentiels:

L'évaluation par immunofluorescence de la jonction neuromusculaire des larves est un système de valeur qui peuvent fournir de précieuses informations sur la biologie synaptique, bien qu'il existe des pièges potentiels qui peuvent limiter l'utilité de ce système. Par exemple, souvent, il est souhaitable de l'image du motif de coloration de deux ou plusieurs anticorps primaires dans le même échantillon. Le choix des anticorps primaires appropriés, les fluorophores appropriés, et des contrôles appropriés négative est essentielle à la réussite.

Si l'imagerie deux antigènes dans votre expérience, être certain que les anticorps primaires sont de différentes espèces de sorte que chaque protéine d'intérêt peut être identifié de façon unique avec un anticorps marqué par fluorescence secondaire. Une méthode recommandée pour réduire de fond est d'utiliser un agent de blocage contenant le sérum normal de l'espèce à partir de laquelle les anticorps secondaires ont été obtenues (par exemple l'utilisation de sérum de chèvre normal comme agent de blocage lors de l'utilisation de chèvre anti-lapin ou anticorps anti-souris secondaire).

Après la planification de l'anticorps primaire et secondaire que vous utiliserez dans votre expérience, vous devez également tenir compte notamment des contrôles dans votre coloration fixe pour s'assurer que le signal fluorescent que vous voyez est réel et pas seulement de fond. Si possible, inclure des échantillons de contrôle négatif qui ne contiennent pas la protéine d'intérêt. Ceci se fait facilement dans les études de surexpression exogène par transgène, y compris un animal de type sauvage, mais dans certains cas peut être accompli en utilisant un mutant homozygote de votre protéine d'intérêt. Un autre contrôle essentiel négative, utile pour mesurer les niveaux de fond de votre signal fluorescent, est d'utiliser l'anticorps secondaire sans inclure le primaire. Quand l'imagerie de votre preps qui en résulte, il est important de comprendre que tous les signaux fluorescents que vous voyez peut-être pas réel, et peut-être de fond de Your anticorps secondaire ou du fond de tissu endogène. Vous pouvez avoir besoin de normaliser vos images à considérer la fluorescence de fond lors des changements entre les dosant l'intensité de fluorescence.

Choix du fluorophore doit également être fait avec soin. Examen de l'excitation et les spectres d'émission pour chaque fluorophore et la capacité à détecter de façon unique chaque signal est indispensable pour éviter saignent canal à travers. S'il ya une incertitude, une façon simple de déterminer si l'ampleur de la saigner à travers est d'immunocoloration avec un seul fluorophore anticorps marqué à la fois et vérifier l'image à chaque canal que vous utiliserez dans votre dernière expérience. Cela devrait révéler si saigner à travers survient avec votre jeu de microscope filtre.

Figure 1. Organigramme de la coupe cuticule et le placement des broches 1-6. Cliquez ici pour agrandir l'image

Figure 2. Placement des larves sur la dernière diapositive. Assurez-vous que les larves sont exposées preps secondaires musculaires et la cuticule côté vers le bas. Laissez au moins une largeur du corps larvaire dans-entre chaque échantillon.

Figure 3. Lorsque l'imagerie, de localiser les muscles et les segments d'intérêt. Commune jonctions neuromusculaires caractérisées muscles innervent 6 / 7, 13 musculaire, le muscle 12, ou musculaires 4. Sur le côté opposé de la ligne médiane ventrale, il ya une structure musculaire image miroir de l'hémi-segment montré. Utilisez Muscle 31 en tant que marqueur pour identifier quel segment vous imagerie. Image des synapses et des segments de même pour le reste de vos échantillons, la collecte de nombreuses images synaptique par génotype qui peut être utilisé pour la quantification.

Figure 4. Une image représentant un maximum de projection d'une partie du muscle JNM innervant 6 / 7 est montré. NC82 (Bruchpilot) coloration est représenté en vert. HRP pré-synaptique tache est représentée en rouge. Notez le punctae zone active qui peut encore être quantifiée par un logiciel d'imagerie.

Discussion

Pour les neurones, la zone du terminal synaptique est d'une importance cruciale, et il est le pont pour une bonne communication entre les post-et pré-synaptique des cellules. Un moyen puissant pour étudier la santé des neurones dans des modèles de la maladie est d'analyser les protéines du terminal synaptique par immunofluorescence. La méthode d'immunofluorescence présenté ici permet au chercheur d'examiner de nombreuses larves simultanément tout en limitant les différences entre les groupes environnementaux. Le système nerveux central de la drosophile troisième stade larvaire a de nombreux avantages, y compris synapses glutamatergiques, cartographiés et répétées terminaisons synaptiques, l'accessibilité, la reproductibilité et la puissance de manipulation génétique. Plus précisément dans les modèles de la maladie chez la drosophile neuronale, les niveaux de l'activité des protéines de zone Bruchpilot a été modifié. Parce que le grand nombre de larves analysés simultanément, l'analyse de la zone active en utilisant la méthode présentée permet au chercheur de détecter des différences subtiles entre les groupes qui pourraient refléter un vice fondamental dans la santé des neurones.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer Base	Dow Corning	68037-59-2	After mixing allow for bubbles to rise slowly out by putting on slow rotator or allowing to sit for 30 minutes or more.
Stainless Steel Minutien PIns	Fine Science Tools	26002-10	Trim to approx. 3-4mm in length with regular scissors
Laminectomy Forceps (Blunt- Used for grasping pins)	Fine Science Tools	11223-20	Use as blunt forceps for grasping pins
Dissection Forceps	World Precision Instruments, Inc.	501985
SuperFine Vannas Scissors, 8cm long	World Precision Instruments, Inc.	501778
Mouse anti-Brp antibody	DSHB	NC82	Use 1:50 dilution
Cy3 Affinipure Goat Anti-Horseradish Peroxidase	Jackson ImmunoResearch	123-165-021	Use at 1:200 dilution
Alexa Fluor 488 Goat anti-Mouse IgG	Invitrogen	A11001	Use approx. 1:200 dilution