Summary
Die neuromuskuläre Verbindung (NMJ) von
Abstract
Die Drosophila-Larven neuromuskulären Synapse (NMJ) ist ein ausgezeichnetes Modell für die Untersuchung der synaptischen Struktur und Funktion. Drosophila ist bekannt für die Leichtigkeit des starken genetischen Manipulationen und die Larven des Nervensystems hat sich besonders bewährt bei der Untersuchung nicht nur die normale Funktion, sondern auch Störungen bekannt daß begleiten einige neurologische Erkrankung (Lloyd und Taylor, 2010). Viele wichtige synaptische Moleküle in Drosophila gefunden werden auch in Säugetieren gefunden und wie die meisten ZNS-Synapsen in Säugetieren ist das Drosophila NMJ glutamatergen und zeigt Aktivität abhängig Umbau (Koh et al., 2000). Darüber hinaus können Drosophila Neuronen werden individuell identifiziert, weil ihre Innervation Muster stereotype und repetitive machen es möglich, identifiziert synaptischen Terminals, wie sie zwischen Motoneuronen und der Körper-Wand Muskelfasern, die sie innervieren (Keshishian und Kim, 2004). Studie Die Existenz der evolutionär konserviert Synapse Komponenten zusammen mit der Leichtigkeit von genetischen und physikalische Manipulation machen die Drosophila-Modell ideal für die Untersuchung der zugrunde liegenden Mechanismen synaptischer Funktion (Budnik, 1996).
Die aktiven Zonen am synaptischen Terminals sind von besonderem Interesse, da diese die Standorte der Freisetzung von Neurotransmittern sind. NC82 ist ein monoklonaler Antikörper, der Drosophila-Protein Bruchpilot (BRP), ein CAST1/ERC Familienmitglied, das ein wichtiger Bestandteil der aktiven Zone (Wagh et al., 2006) wird anerkannt. Brp wurde gezeigt, direkten Einfluss auf die aktive Zone T-bar und ist verantwortlich für die effektive Bündelung Ca 2 +-Kanäle unter dem T-Bar-Dichte (Fouquet et al., 2009). Mutanten von BRP haben Ca 2 + reduziert Kanaldichte, deprimiert evozierte Vesikelfreisetzung und veränderte kurzfristige Plastizität (Kittel et al., 2006). Änderungen an aktiven Zonen in Drosophila Krankheitsmodelle beobachtet worden. Zum Beispiel zeigten Immunfluoreszenz mit dem NC82-Antikörper, der die aktive Zone Dichte in Modellen von amyotrophe Lateralsklerose und Pitt-Hopkins-Syndrom (Ratnaparkhi et al, 2008.; Zweier et al, 2009.) Verringert wurde. So kann die Evaluierung von aktiven Zonen oder anderen synaptischen Proteinen, in Drosophila-Larven Modelle von Krankheiten stellen eine wertvolle erste Hinweise auf die Anwesenheit eines synaptischen Defekt.
Vorbereiten ganzen Berg seziert Drosophila-Larven für Immunfluoreszenz Analyse der NMJ erfordert etwas Geschick, kann aber von den meisten Wissenschaftlern mit ein wenig Übung erreicht werden. Präsentiert wird eine Methode, die für mehrere Larven präpariert und immungefärbt in der gleichen Präparation Gericht stellt, Begrenzung der Umwelt-Unterschiede zwischen den einzelnen Genotyp und bietet genügend Tiere für das Vertrauen in die Reproduzierbarkeit und statistische Analyse.
Protocol
1. Vorbereitung für Immunfluoreszenz:
- So erstellen Sie ein Sezieren Oberfläche, pour Sylgard 184 Silikon-Elastomer Basis in einen kleinen Gewebekulturplatte. Achten Sie darauf, nicht auf die Platte komplett, so dass die Dissektion Bereich niedriger als der Rand zu füllen.
- Trim Dissektion Stifte zu einer Länge von ca. 3,5 mm für eine einfachere Handhabung, und stellen Sie sicher, mindestens 6 Pins pro Larve haben.
- Sie müssen stumpfen Pinzette, mit denen Sie erfassen die Stifte für die Dissektion wird.
2. Dissection der Larven:
- Wählen Sie wandern dritten Larvenstadium, die sich um die Seiten der Flasche kriechen und haben noch nicht begonnen sich zu verpuppen.
- Legen Sie eine Larve auf dem Sezieren Oberfläche unter einem Stereomikroskop. Wick entfernt überschüssige feuchter mit einem Kimwipe.
- Ordnen Sie jedem Larve, so dass die Rückenseite nach oben zeigt. Sie können auf zwei Luftröhre, weiße Linien entlang der Rückenseite der Larven zu sehen. Versuchen Sie, diese Mitte in der Mitte so viel wie möglich, weil dieses Zeichen der dorsalen Mittellinie.
- Legen Sie Pin # 1 knapp oberhalb der Mündung Haken (Abbildung 1).
- Legen Sie Pin # 2 in den Schwanz direkt über die Luftlöcher zwischen den Tracheen.
- Fügen Sie eine kleine Menge von PBS für die Larven zu verhindern Austrocknen der Nagelhaut.
- Wiederholen Sie diese Schritte mit allen Larven, um sicherzustellen, dass die Genotypen räumlich, indem Sie einen Stift zwischen den einzelnen Genotyp getrennt.
- Machen Sie einen kleinen Schnitt quer rechts oben Pin Nr. 2 über beide Luftröhre (Abbildung 1).
- Legen Sie die Schere in den ersten Schnitt und Schnitt entlang der dorsalen Mittellinie zwischen den Tracheen den ganzen Weg bis vergangenen Pin # 1.
- Sie müssen andere kleine Schnitte an der Spitze und unten auf jeder Seite der Nagelhaut zu machen, so dass die linken und rechten Seite öffnet sich damit Sie sie festzunageln, ohne Ziehen an der Nagelhaut.
- Legen Sie Stift # 's 3, 4, 5 und 6 an jeder Ecke.
- Fix die Probe mit 4% PFA für 20-25 Minuten bei Raumtemperatur
- Dekantieren der PFA und gründlich mit PBS 3-4 mal, Dekantieren jeder Zeit.
3. Entfernung von Gewebe:
- Beginnen Sie mit dem Entfernen von Gewebe am hinteren Ende, weil Sie in der Regel auf den Bereich, wo das Gehirn befindet sich schützen wollen.
- Bei Verwendung einer steromicroscope und mit den Larven unter einem Tropfen PBS, zuerst greifen das hintere Ende eines der Luftröhre und ziehen Sie ihn heraus, die möglicherweise einige der fetten Körper mit ihr zu entfernen. Wiederholen Sie dies für die zweite Luftröhre.
- Ergreifen Sie einige der hinteren Fett des Körpers oder der Darm und ziehen sie aus dem prep. Nachdem die meisten der hinteren Gewebe entfernt worden ist, auf die Beseitigung der kleinen Gewebe um das Gehirn zu konzentrieren. Wenn Sie nur in den Muskeln, oder Morphologie der NMJ interessiert sind, können das Gehirn als auch zu entfernen.
- Die Entfernung des Gehirns ermöglicht eine bessere Visualisierung der Muscle 31, die eine hilfreiche Marker für Abdominalsegment Orientierung.
4. Immunfluoreszenz für Active Zones:
- Add Blocker (5% normalem Ziegenserum in PBS), die seziert preps in der Sektion Gericht. Block 1 Stunde bei Raumtemperatur. Wenn Sie möchten, dass nur dann eine Lösung für die Sperrung und Antikörper-Verdünnungen gehören 0,1% TritonX-100 zu Ihrem Blockierungsmittel für Gewebe Permeabilisierung.
- Wenden Sie den primären Antikörper in Blockierungslösung mit 0,1% TritonX-100 verdünnt. Die aktive Zone Antikörper ist erreichbar durch das Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, http://dshb.biology.uiowa.edu/). Verwenden Sie eine Referenz-Antikörper (zB Meerrettichperoxidase-Cy3-Konjugat), um die NMJ Membran und Axone Etikett.
- Inkubieren Sie die primären Antikörper bei 4 ° C über Nacht. So, dass die Trockenheit der Kühlschrank wird nicht verdunsten die Antikörper-Lösung, erstellen Sie eine feuchte Kammer, indem etwas Wasser in den Boden eines gebrauchten Pipettenspitze Feld. Bedecken Sie den transluzenten Deckel mit Alufolie zu fluoreszierenden reduzieren Bleichen. Legen Sie die Dissektion Folie in der feuchten Kammer und legte die ganze Kiste in den 4 ° C Inkubator über Nacht.
- Am nächsten Morgen, mit PBST (PBS mit 0,2% Triton-X-100) 5-10 mal für 5-10 Minuten zu waschen.
- Inkubieren mit dem sekundären Antikörper (zB Invitrogen Alexa Goat anti-Mouse-488) in Blocking-Reagenz mit 0,1% TritonX-100 bei Raumtemperatur für 2-4 Stunden in der überdachten feuchte Kammer verdünnt. Fügen Sie eine Kernfärbung (zB DAPI) in der Sekundarstufe, wenn Sie möchten, um die Position des Kerns in die Muskeln oder das Gehirn zu identifizieren.
- Waschen mit PBST (PBS mit 0,02% Triton-X-100) 5-10 mal für 5-10 Minuten.
5. Montage der Larven Proben auf Folien:
- Dekantieren und Docht aus den letzten PBST waschen.
- Pipette ca. 1 ml 80% Glycerin, die festgenagelt Larven Pelze decken.
- Entfernen 5 der 6 Pins in allen Larven.
- Wenn Sie bereit sind, den ersten Genotyp auf einen Objektträger gebracht entfernen Sie die letzten Bolzen für die Larven, die genotype.
- Bereiten Sie eine "wash" slide, indem man zwei Tropfen Ihres Eindeckmedium auf einen sauberen Objektträger. Dieser Schritt ist wichtig, um das Wasser aus der Lösung und Larven waschen für die Montage und klarer Bildgebung.
- Greifen Sie einen Larve durch den Schwanz mit dem stumpfen Pinzette, ziehen die Larve etwa in dem Glycerin und dann entlang der trockenen Kanten Ihrer Dissektion Gericht, um eine Mehrheit der Glycerin zu entfernen. Legen Sie die Larven im ersten Eindeckmedium fallen.
- Wiederholen Sie Schritt 6 für alle die Larven des gleichen Genotyps.
- Sobald alle Larven sind in den ersten Eindeckmedium fallen, greifen die erste Larve durch den Schweif und ziehen Sie es durch die Tropfen und dann entlang der trockenen Kanten der Schale, um eine Mehrheit des Mediums zu entfernen. Dann legen sich die Larven in der zweiten Eindeckmedium fallen.
- Wiederholen Sie Schritt 8 für alle die Larven mit den gleichen Genotyp.
- Bereiten Sie Ihre letzte Folie durch Etikettierung es schaffen und eine kleine "T" Form Eindeckmedium auf der Folie.
- Wie in Schritt 5,8, greifen die Larve durch den Schwanz; ziehen das Fell über die zweite Eindeckmedium fallen zu lassen und dann entlang der trockenen Seiten der "Wash" slide. Nachdem die Mehrheit des Mediums ist gekommen, versetzen die Larven Fell auf der letzten Folie in der Montage Medium.
- Wiederholen Sie dies für alle Larven Pelze.
- Stellen Sie sicher, dass alle Larven Pelze angeordnet sind, wie gewünscht, sicherzustellen, dass die Nagelhaut Seite nach unten und die freigelegten Muskel nach oben zeigt.
- Legen Sie ein Deckglas auf dem Objektträger, die seziert Larven bedecken, mit dem Beginn Rand in der oberen Zeile des "T."
- Setzen Sie ein kleines Gewicht (zB 9-Volt-Batterie) auf das Deckglas, um sicherzustellen, dass die Montage Medium vollständig verbreitet unter dem Deckglas.
- Zur Reduzierung möglich Fluoreszenzlöschung, legen Sie die Folie in einer Schublade oder dunklen Raum, bis das Eindeckmedium ausgehärtet ist.
- Clean up the Eindeckmedium, dass die Kanten des Deckglases übergelaufen. Reinigen Sie das überschüssige trockene Montage Medium auf das Deckglas oder Objektträger mit 70% Ethanol.
- Um eine endgültige Abdichtung zu schaffen, das Siegel mit Nagellack.
6. Repräsentative Ergebnisse:
Ein Beispiel Folie präpariert und immungefärbt Larven ist in Abbildung 2 dargestellt. Wenn die Larven Dissektionen, Flecken und Montage ordnungsgemäß durchgeführt, kann der Benutzer die Larven Muskel von Interesse (Abbildung 3) in Segmente A2-A6 zu identifizieren. Hoang et al. Enthält eine detaillierte Beschreibung des Muskel-Position sowie Charakterisierung von spezifischen synaptischen boutons (Hoang und Chiba, 2001). Mit Hilfe eines Hochleistungs-Objektiv kann der Anwender auf einer einzigen Synapse zu fokussieren und Z-Stapel-Bild. Ein Vertreter maximale Projektionsbild eines Teils der Synapse 6 / 7 angezeigt wird (Abbildung 4). Dann mit Imaging-Software, können die aktiven Zonen quantitativ, das bei Ihrem Mutantenphänotyps ausgewertet werden. Beispiele für Features, die in einem bestimmten Mutantenphänotyps verändert werden können, beinhalten die Gesamtzahl, Fluoreszenz-Intensität, und der Abstand zwischen den aktiven Zonen.
Mögliche Fallstricke:
Immunfluoreszenz Auswertung der larvalen neuromuskulären Synapse ist ein wertvolles System, das einen wertvollen Einblick in synaptischen Biologie Verfügung stellen kann, obwohl es potenzielle Fallstricke, dass der Nutzen dieses Systems verhindern könnten. Zum Beispiel, häufig ist es wünschenswert, Bild der Färbungsmuster von zwei oder mehr primäre Antikörper in der gleichen Probe. Die Wahl der geeigneten primären Antikörpern, geeignete Fluorophore und entsprechende Negativ-Kontrollen ist entscheidend für den Erfolg.
Wenn Imaging zwei Antigene in Ihrem Experiment, sicher sein, dass die primären Antikörper von verschiedenen Spezies, so dass jedes Protein von Interesse eindeutig mit einem fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörper identifiziert werden. Eine empfohlene Methode, um Hintergrund zu reduzieren, ist ein Blockierungsmittel zu verwenden, die das normale Serum der Spezies, aus der der sekundäre Antikörper abgeleitet (z. B. Einsatz normalem Ziegenserum als Blockierungsmittel bei der Verwendung von Ziege-Anti-Kaninchen-oder anti-Maus Sekundärantikörper) wurden.
Nach der Planung der primären und sekundären Antikörper, die Sie in Ihrem Experiment verwenden, müssen Sie auch einschließlich der Kontrollen in Ihrem Färbung betrachten setzt, um sicherzustellen, dass die Fluoreszenz-Signal, das Sie sehen real und nicht nur Hintergrund ist. Wenn möglich, sind negative Kontrollproben, die keine das Protein von Interesse. Dies ist leicht in Studien von exogenen Transgen-Überexpression durch die Aufnahme eines Wildtyp-Tieren gemacht, aber in manchen Fällen kann durch die Verwendung einer homozygoten Mutante von Ihrem Protein von Interesse durchgeführt werden. Ein weiterer wesentlicher negative Kontrolle, nützlich für die Messung der Hintergrundwerte von Ihrem Fluoreszenzsignal ist an den sekundären Antikörper ohne den primären Einsatz. Bei der Darstellung Ihres resultierenden preps, ist es wichtig zu verstehen, dass alle das Fluoreszenzsignal, dass Sie sehen vielleicht nicht real, und vielleicht Hintergrund von yo werdenur Sekundärantikörper oder aus körpereigenem Gewebe Hintergrund. Möglicherweise müssen Sie Ihre Bilder zu normalisieren, um Hintergrundfluoreszenz berücksichtigen, wenn Testen auf Änderungen zwischen Fluoreszenzintensität.
Wahl der Fluorophor muss auch mit Vorsicht erfolgen. Die Berücksichtigung der Anregungs-und Emissionsspektren für jeden Fluorophor und die Fähigkeit zur eindeutigen Erkennung jedes Signal ist wichtig, Kanal Durchscheinen zu vermeiden. Wenn es eine Unsicherheit, eine einfache Möglichkeit, um festzustellen, ob das Ausmaß der Blutung bis hin zu mit einem Fluorophor-markierten Antikörper in einer Zeit immunostain und überprüfen Sie das Bild mit jedem Kanal, dass Sie in Ihrem letzten Experiment verwenden ist. Dies sollte zeigen, ob Durchscheinen mit Ihrem Mikroskop Filter gesetzt auftritt.
Abbildung 1. Flussdiagramm Nagelhaut schneiden und Platzierung der Pins 1-6. Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen
Abbildung 2. Platzierung der Larven auf den letzten Folie. Stellen Sie sicher, dass die Larven preps Muskel Seite ausgesetzt sind und Nagelhaut Seite nach unten. Lassen Sie mindestens ein Larvenkörpers Breite in-zwischen jeder Probe.
Abbildung 3. Bei der Darstellung, suchen Sie die Muskeln und Segmente von Interesse. Gemeinsame neuromuskulären Synapsen charakterisiert innervieren Muskeln 6 / 7, Muskel-13, Muskel-12, oder Muskel-4. Auf der gegenüberliegenden Seite der ventralen Mittellinie, es ist ein Spiegelbild Muskulatur der dargestellten Hemi-Segment. Verwenden Muscle 31 als einen Marker zu identifizieren, welches Segment Sie Bildgebung. Bild der gleichen Synapsen und Segmente für den Rest Ihrer Proben, sammelt viele synaptische Bilder pro Genotyp, dass für die Quantifizierung verwendet werden können.
Abbildung 4. Ein Vertreter maximale Projektionsbild eines Teils der NMJ innervieren Muskeln 6 / 7 gezeigt. NC82 (Bruchpilot) Färbung ist in grün dargestellt. HRP präsynaptischen Fleck ist rot dargestellt. Notieren Sie sich die aktive Zone Tränenpünktchen, dass weitere von Imaging-Software quantifiziert werden kann.
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Discussion
Für Neuronen wird die synaptische Anschlussbereich von entscheidender Bedeutung, und ist die Brücke für eine ordnungsgemäße Kommunikation zwischen dem post-und pre-synaptischen Zellen. Ein guter Weg, um die Gesundheit des Neurons in Krankheitsmodelle zu untersuchen ist, Proteine der synaptischen Terminals durch Immunfluoreszenz analysiert. Die Immunfluoreszenz hier vorgestellte Methode ermöglicht es dem Forscher, viele Larven gleichzeitig zu untersuchen, während die Begrenzung der ökologischen Unterschiede zwischen den Gruppen. Das zentrale Nervensystem von Drosophila dritten Larvenstadium hat viele Vorteile, einschließlich glutamatergen Synapsen, kartiert und wiederholt synaptischen Terminals, Erreichbarkeit, Reproduzierbarkeit und Macht der genetischen Manipulation. Insbesondere in Drosophila neuronale Erkrankung Modellen hat das Niveau der aktiven Zone Protein Bruchpilot verändert wurden. Aufgrund der großen Anzahl von Larven gleichzeitig untersucht, ermöglicht die aktive Zone Analyse unter Verwendung der vorgestellten Methode der Forscher um subtile Unterschiede zwischen den Gruppen, die eine grundlegende Fehler in der Gesundheit des Neurons widerspiegeln erkennen konnte.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Nael Alami und Dr. Nam Chul Kim für ihre hilfreichen Kommentare zu diesem Manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Base | Dow Corning | 68037-59-2 | After mixing allow for bubbles to rise slowly out by putting on slow rotator or allowing to sit for 30 minutes or more. |
| Stainless Steel Minutien PIns | Fine Science Tools | 26002-10 | Trim to approx. 3-4mm in length with regular scissors |
| Laminectomy Forceps (Blunt- Used for grasping pins) | Fine Science Tools | 11223-20 | Use as blunt forceps for grasping pins |
| Dissection Forceps | World Precision Instruments, Inc. | 501985 | |
| SuperFine Vannas Scissors, 8cm long | World Precision Instruments, Inc. | 501778 | |
| Mouse anti-Brp antibody | DSHB | NC82 | Use 1:50 dilution |
| Cy3 Affinipure Goat Anti-Horseradish Peroxidase | Jackson ImmunoResearch | 123-165-021 | Use at 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-Mouse IgG | Invitrogen | A11001 | Use approx. 1:200 dilution |
References
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