Dissecção e imagem das Zonas de Ativos no Drosophila Junção neuromuscular

Summary

A junção neuromuscular (MNJ) de

Abstract

As larvas Drosophila junção neuromuscular (MNJ) é um excelente modelo para o estudo da estrutura e função sináptica. Drosophila é bem conhecida pela facilidade de poderosas manipulações genéticas e do sistema nervoso das larvas tem-se revelado particularmente útil no estudo não só a função normal, mas também perturbações que acompanham algumas doenças neurológicas (Lloyd e Taylor, 2010). Muitos dos principais moléculas synaptic encontrados em Drosophila também são encontrados em mamíferos e como a maioria das sinapses excitatórias do SNC em mamíferos, o MNJ Drosophila é glutamatérgica e demonstra dependente de atividade de remodelação (Koh et al., 2000). Além disso, os neurônios Drosophila pode ser identificados individualmente, porque os seus padrões de inervação são estereotipados e repetitivos tornando possível estudo identificou terminais sinápticos, como aquelas entre neurônios motores e as fibras do corpo na parede muscular que eles inervam (Keshishian e Kim, 2004). A existência de componentes sinapse evolutivamente conservadas junto com a facilidade de manipulação genética e física tornar o modelo Drosophila ideal para investigar os mecanismos subjacentes função sináptica (Budnik, 1996).

As zonas de ativos nos terminais sinápticos são de particular interesse porque estes são os locais de liberação do neurotransmissor. NC82 é um anticorpo monoclonal que reconhece a proteína Drosophila Bruchpilot (BRP), um membro da família CAST1/ERC que é um componente importante da zona ativa (Wagh et al., 2006). Brp foi mostrado diretamente moldam a zona ativa T-bar e é responsável por efetivamente agrupamento Ca ^{2 +} canais abaixo da densidade de T-bar (Fouquet et al., 2009). Mutantes de Brp reduziram Ca ^{2 +} densidade de canais, a liberação da vesícula deprimido evocada, e plasticidade de curto prazo alterados (Kittel et al., 2006). Alterações às zonas ativas têm sido observadas em modelos de doenças Drosophila. Por exemplo, imunofluorescência usando o anticorpo NC82 mostrou que a densidade zona ativa foi diminuída em modelos de esclerose lateral amiotrófica e síndrome de Pitt-Hopkins (Ratnaparkhi et al, 2008;. Zweier et al, 2009).. Assim, a avaliação das zonas de ativo, ou de outras proteínas sinápticas, em modelos de larvas de Drosophila da doença pode fornecer uma pista valiosa inicial para a presença de um defeito sináptico.

Preparar toda montagem dissecados larvas Drosophila para análise de imunofluorescência do MNJ requer alguma habilidade, mas pode ser realizado pela maioria dos cientistas com um pouco de prática. Apresentada é um método que fornece para as larvas múltiplos a ser dissecados e imunocoradas no prato dissecção mesmo, limitando as diferenças ambientais entre cada genótipo e fornecer animais suficiente para a confiança na reprodutibilidade e análise estatística.

Protocol

1. Preparação para Imunofluorescência:

1. Para criar uma superfície de dissecação, despeje Sylgard 184 Base de Dados de elastômero de silicone em uma pequena placa de cultura de tecidos. Certifique-se de não encher o prato completamente para que a área de dissecção é menor do que o aro.
2. Guarnição pinos de dissecação para um comprimento de cerca de 3,5 mm para maior facilidade de manipulação, e certifique-se de ter pelo menos 6 pinos por larva.
3. Você vai precisar de uma pinça sem corte que permitirá que você alcance os pinos para a dissecção.

2. Dissecção das larvas:

1. Selecione vagando larvas de terceiro estádio que estão rastejando ao redor dos lados do frasco e não começaram a pupate.
2. Coloque uma larva na superfície dissecção sob microscópio estereoscópico. Pavio fora úmido em excesso com um Kimwipe.
3. Organizar cada larva de modo que o lado dorsal é voltada para cima. Você será capaz de ver dois traquéia, linhas brancas ao longo do lado dorsal das larvas. Tente centro desses no meio, tanto quanto possível, porque esta marca a linha média dorsal.
4. Pin lugar # 1 logo acima da boca ganchos (Figura 1).
5. Coloque o pino # 2 na cauda um pouco acima dos espiráculos entre as traquéias.
6. Adicionar uma pequena quantidade de PBS para as larvas para evitar a secagem da cutícula.
7. Repita os passos acima, com todas as larvas, certificando-se que os genótipos são separados espacialmente, colocando um pino entre cada genótipo.
8. Faça um pequeno corte transversal direito acima pin # 2 em ambas as traquéias (Figura 1).
9. Insira o seu tesoura no primeiro corte e corte ao longo da linha média dorsal entre as traquéias todo o caminho até o pino passado # 1.
10. Você terá de fazer outros cortes pequenos na parte inferior e superior de cada lado da cutícula, de modo que os lados esquerdo e direito irá abrir o que lhe permite fixá-los para baixo, sem puxar a cutícula.
11. Coloque o pino # 's 3, 4, 5 e 6 em cada canto.
12. Fixar a amostra com PFA 4% para 20-25 minutos em temperatura ambiente
13. Decantar a PFA e enxaguar com PBS 3-4 vezes, decantação de cada vez.

3. Remoção de tecido:

1. Comece por retirar tecidos na extremidade posterior, porque normalmente você deseja proteger a área onde o cérebro está localizado.
2. Enquanto estiver usando uma steromicroscope e com as larvas em uma gota de PBS, primeiro pegue a extremidade posterior de um dos traquéia e puxe-o que pode remover alguns dos de gordura corporal com ele. Repita o procedimento para a traquéia segundo.
3. Pegar alguns do corpo posterior gordura ou intestino e retirá-los da prep. Uma vez que a maior parte do tecido posterior tenha sido removido, o foco na remoção dos tecidos pequenos ao redor do cérebro. Se você está interessado somente nos músculos, ou morfologia do MNJ você pode remover o cérebro também.
4. Remoção do cérebro permite uma melhor visualização do músculo 31, que é um marcador útil para orientação segmento abdominal.

4. Imunofluorescência para Zonas de atividade:

1. Adicionar agente de bloqueio (5% soro de cabra normal em PBS) para o preps dissecados no prato dissecção. Bloco para uma hora em temperatura ambiente. Se você gostaria de fazer apenas uma solução para o bloqueio e anticorpos diluições, incluem 0,1% tritonX-100 ao seu agente de bloqueio para permeabilização do tecido.
2. Aplicar o anticorpo primário diluído em bloqueio reagente com 0,1% tritonX-100. O anticorpo zona ativa é atingível através do desenvolvimento Estudos Hibridoma Bank (DSHB, http://dshb.biology.uiowa.edu/). Use um anticorpo de referência (por exemplo, horseradish peroxidase-Cy3 conjugado) para rotular a membrana MNJ e axônios.
3. Incubar os anticorpos primários, a 4 ° C durante a noite. De modo que a secura do frigorífico não irá evaporar a solução de anticorpos, criar uma câmara de umidade, colocando um pouco de água no fundo de uma caixa utilizada pipeta ponta. Cobrir a tampa translúcida com folha de alumínio para reduzir fluorescentes de branqueamento. Coloque o slide dissecção na câmara de umidade e colocar a caixa inteira no 4 ° C incubadora durante a noite.
4. Na manhã seguinte, lave com PBST (PBS com 0,2% Triton-X-100) 5-10 vezes por 5-10 minutos cada.
5. Incube com o anticorpo secundário (por exemplo, Invitrogen Goat Alexa anti-Mouse-488) diluído em bloqueio reagente com 0,1% tritonX-100 à temperatura ambiente por 2-4 horas na câmara de umidade coberto. Incluem uma mancha nuclear (por exemplo, DAPI) no secundário, se você gostaria de identificar a localização do núcleo nos músculos ou cérebro.
6. Lavar com PBST (PBS com 0,02% Triton-X-100) 5-10 vezes por 5-10 minutos cada.

5. Amostras de montar o Larval em Slides:

1. Decantar e pavio fora a lavagem PBST passado.
2. Pipetar 1mL de glicerol cerca de 80% para cobrir as peles preso larval.
3. Remove 5 dos 6 pinos em todas as larvas.
4. Quando você está pronto para colocar o genótipo primeiro em um slide remova o pino durar todas as larvas desse genótipope.
5. Prepare um "lavar" slide colocando duas gotas de seu meio de montagem sobre uma lâmina limpa. Este passo é importante lavar a solução de água fora das larvas para a montagem e clara imagem.
6. Agarre uma larva pela cauda com o fórceps sem corte, arraste a larva em torno do glicerol e, em seguida, ao longo das bordas seca do seu prato dissecção, para remover a maioria dos glicerol. Coloque as larvas na gota primeiro meio de montagem.
7. Repita a etapa 6 para todas as larvas do mesmo genótipo.
8. Uma vez que todas as larvas estão em queda primeiro meio de fixação, agarre a primeira larva pelo rabo e puxá-lo através da gota e, em seguida, ao longo das bordas do prato seco para remover a maioria do meio. Em seguida, coloque as larvas na gota segundo meio de montagem.
9. Repita o passo 8 para todas as larvas com o mesmo genótipo.
10. Prepare o seu slide final, rotulando-o e colocando uma pequena forma de "T" de meio de montagem no slide.
11. Como no passo 5.8, agarrar a larva pela cauda; puxar a pele através da gota média segundo a montagem e, em seguida, ao longo dos lados da seca "Wash" slide. Depois que a maioria do meio veio fora, coloque o pelt larval no slide final no meio de montagem.
12. Repita o procedimento para todas as peles larval.
13. Certifique-se de que todas as peles larval são organizados como desejado certificando-se que o lado cutícula é baixo e os músculos expostos é voltada para cima.
14. Coloque uma lamínula sobre o slide para cobrir as larvas dissecadas, com a borda de partida na linha superior do "T"
15. Coloque um pequeno peso (por exemplo, bateria de 9 volts) na lamínula, certificando-se que o meio de montagem espalha completamente sob a lamínula.
16. Para reduzir quenching fluorescentes possível, coloque o slide em uma gaveta ou um espaço escuro até o meio de montagem curou.
17. Limpar o meio de montagem que transbordam das bordas da lamínula. Limpe meio secos excesso de montagem na lamínula ou slide com etanol 70%.
18. Para criar um selo final, selar com unha polonês.

6. Resultados representativos:

Um slide de exemplo de larvas dissecadas e imunocoradas é mostrado na Figura 2. Quando a dissecção larvas, manchas, e de montagem são feitos corretamente, o usuário pode identificar o músculo larvas de interesse (Figura 3) em segmentos A2 A6. Hoang et al. Fornece uma descrição detalhada da posição muscular, bem como caracterização de específicas boutons sináptica (Hoang e Chiba, 2001). Usando um objetivo de alta potência que o usuário possa se concentrar em uma única sinapse e tomar z-stack da imagem. Um representante da imagem de projeção máxima de uma porção de sinapse 07/06 é mostrada (Figura 4). Em seguida, usando software de imagem, as zonas de ativos podem ser quantitativamente avaliados por características que são específicas para o seu fenótipo mutante. Exemplos de recursos que poderá ser alterada em um fenótipo específico mutante incluir o número total, intensidade Fluorescência e espaçamento entre zonas ativo.

Armadilhas em potencial:

Avaliação de imunofluorescência da junção neuromuscular larval é um sistema valioso que pode fornecer informações valiosas sobre a biologia sináptica, embora haja perigos potenciais que podem limitar a utilidade deste sistema. Por exemplo, freqüentemente é desejável para a imagem do padrão de coloração de dois ou mais anticorpos primários na mesma amostra. A escolha dos anticorpos primários adequados, fluoróforos apropriado e adequado controles negativos é essencial para o sucesso.

Se dois antígenos de imagem na sua experiência, a certeza de que os anticorpos primários são de espécies diferentes de modo que cada proteína de interesse pode ser identificado exclusivamente com um anticorpo fluorescente etiquetado secundário. A forma recomendada para reduzir a fundo é a utilização de um agente de bloqueio contendo o soro normal da espécie de que os anticorpos secundários foram derivados (por exemplo, usar soro normal de cabra como um agente de bloqueio quando se utiliza de cabra anti-coelho ou rato anticorpos anti-secundário).

Após o planejamento dos anticorpos primário e secundário que você irá usar em sua experiência, você também deve considerar a inclusão de controles na sua coloração sets para garantir que o sinal fluorescente que você está vendo é real e não apenas de fundo. Se possível, inclua amostras de controlo negativas que não contêm a proteína de interesse. Isso é facilmente feito em estudos de superexpressão transgene exógenos, incluindo um animal do tipo selvagem, mas em alguns casos pode ser feito usando um mutante homozigoto de sua proteína de interesse. Outro controle essencial negativo, útil para medir os níveis de fundo de seu sinal fluorescente, é a utilização do anticorpo secundário sem incluir o primário. Quando o seu preps imagem resultante, é importante entender que todos os sinais fluorescentes que você está vendo pode não ser real, e pode ser de fundo de your anticorpos secundários ou de fundo de tecido endógeno. Você pode precisar para normalizar suas imagens a considerar fluorescência de fundo quando se examina as mudanças entre a intensidade de fluorescência.

Escolha de fluoróforo também deve ser feita com cuidado. Consideração da excitação e espectros de emissão para cada fluoróforo ea capacidade de detectar exclusivamente cada sinal é essencial para evitar sangrar canal através do. Se há alguma incerteza, uma maneira simples de determinar se a extensão da hemorragia é através immunostain com um anticorpo marcado com fluoróforo de cada vez e verifique a imagem com cada canal que você irá utilizar em sua experiência final. Isso deve revelar se sangrar através está ocorrendo com seu conjunto de microscópio filtro.

Figura 1. Fluxograma de cortar cutícula e colocação de pinos 1-6. Clique aqui para ver uma imagem maior

Figura 2. Colocação de larvas no slide final. Certifique-se que o preps larvas são expostas lado do músculo para cima e para baixo do lado cutícula. Deixe pelo menos uma largura do corpo larval entre cada amostra.

Figura 3. Quando imagem, localize os músculos e segmentos de interesse. Comum junções neuromusculares caracterizadas músculos inervam 07/06, músculo 13, 12 músculos, ou músculo 4. No lado oposto da linha média ventral, há um espelho estrutura muscular imagem do mostrado hemi-segmento. Use Muscle 31 como um marcador para identificar qual o segmento que você está imaginando. A imagem da mesma sinapses e segmentos para o resto de suas amostras, coletando muitas imagens sináptica por genótipo que pode ser usado para a quantificação.

Figura 4. A imagem de projeção representante máximo de uma porção do músculo MNJ inervam 07/06 é mostrado. NC82 coloração (Bruchpilot) é mostrada em verde. HRP pré-sináptica da mancha é mostrado em vermelho. Observe o punctae zona ativa que pode ser ainda quantificada pelo software de imagem.

Discussion

Para os neurônios, a área terminal sináptico é de fundamental importância, e é a ponte para a comunicação adequada entre o pós e pré-sináptica células. Uma forma poderosa para investigar a saúde do neurônio em modelos de doença é analisar proteínas do terminal sináptico por imunofluorescência. O método de imunofluorescência apresentado aqui permite que o pesquisador examine muitas larvas simultaneamente, limitar as diferenças ambientais entre os grupos. O sistema nervoso central de Drosophila larvas do terceiro instar tem muitas vantagens, incluindo sinapses glutamatérgicas, mapeados e repetiu terminais sinápticos, acessibilidade, reprodutibilidade e poder de manipulação genética. Especificamente em modelos de doenças Drosophila neuronal, os níveis da proteína ativa zona Bruchpilot foi alterado. Por causa do grande número de larvas analisadas simultaneamente, a análise zona ativa usando o método apresentado permite que o pesquisador para detectar diferenças sutis entre os grupos que poderiam refletir um defeito fundamental na saúde do neurônio.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer Base	Dow Corning	68037-59-2	After mixing allow for bubbles to rise slowly out by putting on slow rotator or allowing to sit for 30 minutes or more.
Stainless Steel Minutien PIns	Fine Science Tools	26002-10	Trim to approx. 3-4mm in length with regular scissors
Laminectomy Forceps (Blunt- Used for grasping pins)	Fine Science Tools	11223-20	Use as blunt forceps for grasping pins
Dissection Forceps	World Precision Instruments, Inc.	501985
SuperFine Vannas Scissors, 8cm long	World Precision Instruments, Inc.	501778
Mouse anti-Brp antibody	DSHB	NC82	Use 1:50 dilution
Cy3 Affinipure Goat Anti-Horseradish Peroxidase	Jackson ImmunoResearch	123-165-021	Use at 1:200 dilution
Alexa Fluor 488 Goat anti-Mouse IgG	Invitrogen	A11001	Use approx. 1:200 dilution