Summary
Нервно-мышечном соединении (NMJ) из
Protocol
1. Подготовка к иммунофлуоресценции:
- Чтобы создать рассекает поверхность, залить 184 Sylgard силиконового эластомера базы в небольшую тарелку культуры ткани. Удостоверьтесь, чтобы не заполнить пластины полностью, так что вскрытие области ниже, чем обод.
- Trim рассечение булавками к длине приблизительно 3,5 мм для повышения простоты манипуляций, и убедитесь, что по крайней мере 6 штырьков в личинку.
- Вам нужно будет тупой пинцет, который позволит вам понять булавки для вскрытия.
2. Препарирование Личинки:
- Выберите блуждающих третьего возраста личинок, которые ползают по бокам флакона и не начали окукливаются.
- Место личинки на вскрытие поверхности под стереомикроскопа. Вика излишки влажных использованием Kimwipe.
- Упорядочить каждой личинки, так что спинной стороной вверх. Вы сможете увидеть два трахеи, белые линии вдоль спинной стороны личинки. Попробуйте центра них в среднем как можно больше, потому что это знаменует собой спинной средней линии.
- Место контакт номер 1 чуть выше устья крючка (рис. 1).
- Место контакт номер 2 в хвост чуть выше дыхальца между трахеи.
- Добавить небольшое количество PBS, чтобы личинки, чтобы предотвратить высыхание кутикулы.
- Повторите эти шаги со всеми личинки, убедившись, что генотипы разделены пространственно путем размещения контактных между генотипом.
- Сделать небольшие поперечные право голову выше вывод № 2 на обоих трахеи (рис. 1).
- Вставьте ножницами в первый разрез и разрез по средней линии спинной между трахеи все, вплоть до прошлого контакт номер 1.
- Вам нужно будет делать другие небольшие порезы на самом верху и внизу каждой стороны кутикулы, таким образом, чтобы левая и правая стороны откроется позволяет прикрепить их без потянув за кутикулой.
- Место контактный # 'ы 3, 4, 5 и 6 на каждом углу.
- Fix образца с 4% PFA в течение 20-25 минут при комнатной температуре
- Декантируйте PFA и промыть 3-4 раза PBS, разливая каждый раз.
3. Удаление ткани:
- Начните с удаления тканей на заднем конце, потому что обычно вы хотите защитить область, где мозг находится.
- При использовании steromicroscope и с личинками под капли PBS, во-первых захватить задним концом одного из трахеи и вытащить его, которые могут удалить часть жира в организме с ним. Повторите эти действия для второго трахеи.
- Захватите некоторые задним жира или кишечника и вытащить их из преп. Как только большая часть задней ткань была удалена, сосредоточиться на устранении небольших тканей, окружающих мозг. Если вы заинтересованы только в мышцах, или морфологию NMJ можно удалить мозга, а также.
- Удаление мозга позволяет улучшить визуализацию мышцы 31, который является полезным маркером брюшной ориентации сегменте.
4. Иммунофлуоресценции для активных зон:
- Добавить блокирующий агент (5% нормальной сыворотки козьего в ПБС) для расчлененный подготавливает в рассечение блюдо. Блок в течение 1 часа при комнатной температуре. Если вы хотели бы сделать только одно решение для блокировки и разведения антител, включают 0,1% TritonX-100 к блокирующий агент для ткани пермеабилизации.
- Применить Первичные антитела разводят в блокирующий реагент с 0,1% TritonX-100. Активные антитела зоны достигается через развитием исследований Гибридома банк (DSHB, http://dshb.biology.uiowa.edu/). Используйте ссылки антитела (например пероксидазой хрена Cy3 сопряженным) к этикетке мембраны NMJ и аксонов.
- Инкубируйте первичных антител при 4 ° С в течение ночи. Так что сухость холодильник не будет испаряться раствор антитела, создать камере влажности, положив немного воды в нижней части окна использовали наконечник пипетки. Обложка полупрозрачная крышка с алюминиевой фольгой, чтобы уменьшить флуоресцентные отбеливания. Место вскрытия слайда в камере влажности и положить целую коробку в 4 ° C инкубаторе на ночь.
- Следующим утром, промыть PBST (PBS с 0,2% Triton-X-100) 5-10 раз в течение 5-10 минут каждый.
- Инкубируйте с вторичными антителами (например, Invitrogen Alexa антимышиного-488) разводят в блокирующий реагент с 0,1% TritonX-100 при комнатной температуре на 2-4 часа в закрытой камере влажности. Включите ядерной пятна (например, DAPI) на вторичном, если вы хотите определить местоположение ядра в мышцы или мозга.
- Промыть PBST (PBS с 0,02% Тритон-Х-100) 5-10 раз в течение 5-10 минут каждый.
5. Монтаж личинок Образцы на слайдах:
- Декантировать и фитиль от последнего мыть PBST.
- Внесите примерно 1 мл 80% глицерина, чтобы покрыть придавленный личиночных шкурок.
- Удалите 5 из 6 контактов во всех личинок.
- Когда вы будете готовы поставить первый генотип на слайде удалить последний вывод для всех личинок, что genotyре.
- Подготовка "мыть" слайд, поместив две капли вашей установки среды на чистую слайда. Этот шаг важен, мыть водным раствором с личинками для монтажа и четкие изображения.
- Захватите одну личинку за хвост с тупым пинцетом, перетащите вокруг личинки в глицерина, а затем по сухой краев рассечение блюдо, снять большинство глицерина. Место личинок в первые монтажа среду капли.
- Повторите шаг 6 для всех личинок одного и того же генотипа.
- После того как все личинки в первом монтаже среду падение, схватить первый личинка за хвост и тянуть его через падение и затем по сухой краям блюда, чтобы удалить большинство среде. Затем поместите личинки во второй монтажа среду капли.
- Повторите шаг 8 для всех личинок с тем же генотипом.
- Подготовьте свой заключительный слайд, назвав его и размещения малых "Т" формы монтажа среды на слайде.
- Как и в шаге 5.8, захватить личинка за хвост, тянуть шкуру через второй монтажа падение средних и затем по сухой стороны "Мойте" слайда. После большинство среде оторваться, место личиночной шкуру на окончательный слайд в монтажной средой.
- Повторите эти действия для всех личиночных шкурок.
- Убедитесь, что все личиночные шкуры расположены как хотелось бы убедиться, что кутикула стороной вниз и подвергается мышца вверх.
- Место покровным стеклом на слайде, чтобы покрыть расчлененный личинки, с начала краю в верхней строке "Т."
- Положите небольшой вес (например, 9-вольтовой батареи) на покровное стекло, убедившись, что монтаж среду распространяется полностью под покровным стеклом.
- Для снижения возможных флуоресцентные закалки, место слайда в ящик или темное пространство до монтажа среде вылечить.
- Очистка монтажа среда, которая переполнена краями покрытия скольжения. Очистите избыток сухого монтажа среды на скольжение крышкой или слайд с 70% этанола.
- Чтобы создать окончательный печать, печать с ногтей.
6. Представитель Результаты:
Например слайд расчленены и immunostained личинок показано на рисунке 2. Когда личинки вскрытия, пятна, и монтаж выполняются должным образом, пользователь может определить личинки мышц интереса (рис. 3) в сегментах А2-А6. Хоанг и соавт. Предусматривает подробное описание мышц позиции, а также характеристик конкретных синаптических boutons (Хоанг и Тиба, 2001). Использование высоких целей власть пользователь может сосредоточиться на одном синапсе и принять Z-Stack изображения. Проекция представитель максимальной образ части синапса 6 / 7 Показано (рис. 4). Затем, используя для обработки изображений, активные зоны могут быть количественно оценены характеристики, которые свойственны для вашего мутантного фенотипа. Примеры функций, которые могут быть изменены в частности мутантного фенотипа включают общее количество, flourescence интенсивности, а расстояние между активными зонами.
Потенциальные ловушки:
Иммунофлуоресценции оценки личиночной соединения нервно-мышечной является ценным системы, которые могут предоставить ценную информацию о синаптической биологии, хотя Существуют потенциальные проблемы, которые могут ограничить полезность этой системы. Например, часто желательно изображение окрашивания узор из двух или более первичных антител в одном образце. Выбор соответствующих первичных антител, соответствующие флуорофоров, а также соответствующие отрицательного контроля имеет важное значение для успеха.
Если изображение двух антигенов в эксперименте, быть уверенным, что первичные антитела из разных видов, так что каждый белок может быть однозначно идентифицированы с флуоресцентно меченых вторичных антител. Рекомендуемый способ уменьшить фон является использование блокаторов содержащих нормальную сыворотку видов, от которых вторичные антитела были получены (например, использование нормальной козьей сывороткой, как блокирующий агент при использовании козьего анти-кролика или анти-мышь вторичного антитела).
После планирования первичного и вторичного антитела, которые вы будете использовать в своем эксперименте, необходимо также рассмотреть вопрос о включении управления в окрашивании наборов для того, чтобы флуоресцентный сигнал, что вы видите, это реальная, а не просто фоном. Если это возможно, включать отрицательные контрольные образцы, не содержащие белок. Это легко сделать при изучении экзогенных экспрессией трансгенов, включив дикое животное типа, но в некоторых случаях может быть достигнуто с помощью гомозиготных мутантов вашего белок. Другой существенный отрицательный контроль, полезные для измерения фоновых уровней вашей флуоресцентный сигнал, заключается в использовании вторичного антитела, не включая первичные. При визуализации вашего результате подготавливает, важно понимать, что все флуоресцентный сигнал, что вы видите, не может быть реальным, и может быть фоном от до летУра вторичными антителами или из эндогенных фоне ткани. Вам может понадобиться для нормализации изображений рассмотреть фоновой флуоресценции, когда опробование для изменения между интенсивности флуоресценции.
Выбор флуорофора также должно быть сделано с большой осторожностью. Рассмотрение возбуждения и спектры излучения для каждого флуорофора и возможность однозначно обнаружения каждого сигнала необходимо, чтобы избежать кровотечения через канал. Если есть неопределенность, простой способ определить, является ли степень кровоточить через это immunostain с одного флуорофора меченых антител в то время, и проверить, изображение с каждого канала, который вы будете использовать в своей окончательной эксперимента. Это должно выявить, если кровотечение происходит через с микроскопом набор фильтров.
Рисунок 1. Блок-схема обрезания кутикулы и размещение контактов 1-6. Щелкните здесь для просмотра больших изображений
Рисунок 2. Размещение личинок на заключительный слайд. Убедитесь, что личинки подвергаются подготавливает мышцы вверх и кутикулы стороной вниз. Оставьте как минимум личиночной ширина тела в промежутке между каждого образца.
Рисунок 3. Когда изображения, найдите мышцы и сегментов, представляющих интерес. Общие нервно-мышечных контактов характеризуется иннервируют мышцы 6 / 7, 13 мышц, мышечные 12, или мышцы 4. На противоположной стороне брюшной средней линии, есть мышцы зеркальным отражением структуры показали геми-сегменте. Используйте мышцы 31 в качестве маркера для определения, какой сегмент вы изображений. Изображение же синапсов и сегменты для остальных ваших образцов, собирая много синаптических изображений в генотипе, которые могут быть использованы для количественной оценки.
Рисунок 4. Представителем проецирования изображения максимум часть NMJ иннервирующих мышцы 6 / 7 показан. NC82 (Bruchpilot) окрашивания показана зеленым цветом. HRP пресинаптических пятно отображается красным цветом. Обратите внимание на активную punctae зоны, которая может быть дополнительно количественно с помощью ПО для обработки изображений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для нейронов, синаптических площадь терминала имеет решающее значение, и является мостом для надлежащей связи между пост-и пресинаптических клетках. Эффективный способ исследовать здоровье нейронов при болезни моделей для анализа белков синаптических терминала иммунофлюоресценции. Иммунофлуоресценции метод, представленный здесь позволяет исследователю изучить много личинок одновременно ограничивая при этом экологических различий между группами. Центральной нервной системы дрозофилы третьего возраста личинок имеет много преимуществ, в том числе глутаматергической синапсов, отображается и повторил синаптических терминалов, доступность, воспроизводимость и силу генетических манипуляций. В частности у дрозофилы нейронные модели заболевания, уровни активной зоны белка Bruchpilot была изменена. Из-за большого количества личинок анализировали одновременно, активного анализа зону с помощью метода, изложенного позволяет исследователю обнаружить тонкие различия между группами, которые могли бы отражать существенные нарушения в здоровье нейрона.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим доктора Nael Алами и доктор Нам Чул Ким за полезные комментарии об этой рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Base | Dow Corning | 68037-59-2 | After mixing allow for bubbles to rise slowly out by putting on slow rotator or allowing to sit for 30 minutes or more. |
| Stainless Steel Minutien PIns | Fine Science Tools | 26002-10 | Trim to approx. 3-4mm in length with regular scissors |
| Laminectomy Forceps (Blunt- Used for grasping pins) | Fine Science Tools | 11223-20 | Use as blunt forceps for grasping pins |
| Dissection Forceps | World Precision Instruments, Inc. | 501985 | |
| SuperFine Vannas Scissors, 8cm long | World Precision Instruments, Inc. | 501778 | |
| Mouse anti-Brp antibody | DSHB | NC82 | Use 1:50 dilution |
| Cy3 Affinipure Goat Anti-Horseradish Peroxidase | Jackson ImmunoResearch | 123-165-021 | Use at 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-Mouse IgG | Invitrogen | A11001 | Use approx. 1:200 dilution |
References
- Budnik, V. Synapse maturation and structural plasticity at Drosophila neuromuscular junctions. Curr Opin Neurobiol. 6, 858-867 (1996).
- Fouquet, W., Owald, D., Wichmann, C., Mertel, S., Depner, H., Dyba, M., Hallermann, S., Kittel, R. J., Eimer, S., Sigrist, S. J. Maturation of active zone assembly by Drosophila Bruchpilot. J Cell Biol. 186, 129-145 (2009).
- Hoang, B., Chiba, A. Single-Cell Analysis of Drosophila Larval Neuromuscular Synapses. Developmental Biology. 229, 55-70 (2001).
- Keshishian, H., Kim, Y. -S. Orchestrating development and function: retrograde BMP signaling in the Drosophila nervous system. Trends in Neurosciences. 27, 143-147 (2004).
- Kittel, R. J., Wichmann, C., Rasse, T. M., Fouquet, W., Schmidt, M., Schmid, A., Wagh, D. A., Pawlu, C., Kellner, R. R., Willig, K. I., Hell, S. W., Buchner, E., Heckmann, M., Sigrist, S. J. Bruchpilot Promotes Active Zone Assembly, Ca2+ Channel Clustering, and Vesicle Release. Science. 312, 1051-1054 (2006).
- Koh, Y. H., Gramates, L. S., Budnik, V. Drosophila larval neuromuscular junction: Molecular components and mechanisms underlying synaptic plasticity. Microscopy Research and Technique. 49, 14-25 (2000).
- Lloyd, T. E., Taylor, J. P. Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease. Ann N Y Acad Sci. 1184, e1-e20 (2010).
- Ratnaparkhi, A., Lawless, G. M., Schweizer, F. E., Golshani, P., Jackson, G. R. A Drosophila model of ALS: human ALS-associated mutation in VAP33A suggests a dominant negative mechanism. PLoS One. 3, e2334-e2334 (2008).
- Wagh, D. A., Rasse, T. M., Asan, E., Hofbauer, A., Schwenkert, I., Dürrbeck, H., Buchner, S., Dabauvalle, M. -C., Schmidt, M., Qin, G., Wichmann, C., Kittel, R., Sigrist, S. J., Buchner, E. Bruchpilot, a Protein with Homology to ELKS/CAST, Is Required for Structural Integrity and Function of Synaptic Active Zones in Drosophila. Neuron. 49, 833-844 (2006).
- Zweier, C., Jong, E. K. de, Zweier, M., Orrico, A., Ousager, L. B., Collins, A. L., Bijlsma, E. K., Oortveld, M. A., Ekici, A. B., Reis, A., Schenck, A., Rauch, A. CNTNAP2 and NRXN1 are mutated in autosomal-recessive Pitt-Hopkins-like mental retardation and determine the level of a common synaptic protein in Drosophila. Am J Hum Genet. 85, 655-666 (2009).
