Dissekering och Imaging av Active Zoner i Drosophila Neuromuskulära förbindelsen

Summary

Den neuromuskulära förbindelsen (NMJ) av

Abstract

Den Drosophila larver neuromuskulära förbindelsen (NMJ) är en utmärkt modell för studier av synaptiska struktur och funktion. Drosophila är välkänd för hur lätt av kraftfulla genetiska manipulationer och larver nervsystemet har visat sig särskilt användbara för att studera inte bara normal funktion, men också störningar som följer med en del neurologiska sjukdomar (Lloyd och Taylor, 2010). Många viktiga synaptiska molekyler som finns i Drosophila finns också hos däggdjur och som de flesta CNS retande synapser i däggdjur, är Drosophila NMJ glutamaterg och visar aktivitet beroende ombyggnad (Koh et al., 2000). Dessutom kan Drosophila nervceller kan identifieras eftersom deras innervation mönster är stereotypa och repetitiva vilket gör det möjligt att studera identifierats synaptiska terminaler, till exempel mellan motoriska nervceller och kroppen vägg muskelfibrer att de innerverar (Keshishian och Kim, 2004). Förekomsten av evolutionärt bevarat synaps komponenter tillsammans med enkel genetisk och fysisk manipulation gör Drosophila modell idealisk för att undersöka mekanismerna bakom synaptiska funktion (Budnik, 1996).

Den aktiva zoner på synaptiska terminaler är av särskilt intresse eftersom dessa är områden av signalsubstansen release. NC82 är en monoklonal antikropp som erkänner Drosophila proteinet Bruchpilot (BRP), en CAST1/ERC familjemedlem som är en viktig del av den aktiva zonen (Wagh et al., 2006). BRP visades direkt forma den aktiva zonen T-bar och är ansvarig för att effektivt klustring Ca ^{2 +-kanaler} under T-stången densitet (Fouquet et al., 2009). Mutanter av BRP har minskat Ca ^{2 +-kanal} densitet, deprimerad framkallade vesikler release, och förändrade kortsiktiga plasticitet (Kittel et al., 2006). Ändringar aktiva zoner har observerats hos Drosophila sjukdom modeller. Till exempel visade immunofluorescens med NC82 antikropp som den aktiva zonen tätheten sänktes i modeller av amyotrofisk lateralskleros och Pitt-Hopkins syndrom (Ratnaparkhi et al, 2008;. Zweier et al, 2009.). Således kan bedömningen av aktiva zoner eller andra synaptiska proteiner i Drosophila larver modeller av sjukdomen ett värdefullt första ledtråd till förekomsten av en synaptisk defekt.

Förbereda hela montering dissekeras Drosophila larver för immunofluorescens analys av NMJ kräver en del skicklighet, men kan uppnås genom att de flesta forskare med lite övning. Presenteras är en metod som möjliggör flera larver som skall dissekeras och immunostained i samma dissektion maträtt, vilket begränsar miljömässiga skillnader mellan varje genotyp och ger tillräcklig djur för förtroendet reproducerbarhet och statistisk analys.

Protocol

1. Förberedelse för Immunfluorescens:

1. För att skapa en dissekera yta, häll Sylgard 184 Base Silicone Elastomer i en liten vävnadskultur plattan. Se till att inte fylla tallriken helt så att dissektion området är lägre än fälgen.
2. Trimma dissektion stift till en längd av ca 3,5 mm för ökad enkel manipulation, och se till att ha minst 6 stift per larv.
3. Du behöver trubbig pincett som gör att man håller om stiften för dissekering.

2. Dissektion av larver:

1. Välj vandrande third INSTAR larver som kryper runt sidorna på flaskan och har inte börjat förpuppas.
2. Placera en larv på dissekering ytan under ett stereomikroskop. Wick bort överflödigt fuktigare med en Kimwipe.
3. Ordna varje larv, så att ryggen är vänd uppåt. Du kommer att kunna se två luftstrupe, vita linjer längs ryggens sidan av larver. Försök att centrera dessa i mitten så mycket som möjligt eftersom det markerar den dorsala mittlinjen.
4. Placera pin # 1 precis ovanför munnen krokar (Figur 1).
5. Placera pin # 2 i svansen ovanför spiracles mellan tracheae.
6. Tillsätt en liten mängd av PBS för att larverna att motverka uttorkning av nagelbanden.
7. Upprepa ovanstående steg med alla de larver, och se till att genotyper separeras rumsligt genom att placera en nål mellan varje genotyp.
8. Gör ett litet tvärsnitt rakt ovanför pin # 2 på båda tracheas (Figur 1).
9. Sätt in en sax i första skär och skär längs ryggens mittlinje mellan tracheas hela vägen upp förbi pin # 1.
10. Du kommer att behöva göra andra små snitt i den absoluta toppen och botten av varje sida av nagelbanden, så att vänster och höger sida kommer att öppna upp så att du kan pin ner dem utan att dra på nagelbanden.
11. Placera pin # s 3, 4, 5 och 6 i varje hörn.
12. Fixera provet med 4% PFA i 20-25 minuter i rumstemperatur
13. Häll av PFA och skölj med PBS 3-4 gånger, dekantering varje gång.

3. Avlägsnande av vävnad:

1. Börja med att ta bort vävnad i bakändan eftersom vanligtvis du vill skydda området där hjärnan befinner sig.
2. När du använder en steromicroscope och med larverna under en droppe PBS, först ta tag i den bakre änden av en av luftstrupe och dra ut den som kan ta del av det fett kroppen med den. Upprepa för den andra luftstrupen.
3. Ta del av de bakre fett kroppen eller tarmen och dra dem ur prep. När de flesta av de bakre vävnad har tagits bort, fokusera på att ta bort de små vävnaderna runt hjärnan. Om du bara intresserad av i musklerna, eller morfologi NMJ du kan ta bort hjärnan också.
4. Borttagning av hjärnan ger bättre visualisering av Muscle 31, vilket är en bra markör för buken segmentet orientering.

4. Immunfluorescens för Active zoner:

1. Lägg blockerare (5% Normal Goat Serum i PBS) till dissekerat Preps i dissekering skålen. Block i 1 timme i rumstemperatur. Om du vill bara göra en lösning för blockering och antikroppar spädningar, innehålla 0,1% TritonX-100 till din blockerande medel för mjukpapper permeabilization.
2. Applicera den primära antikroppen spätts i blockerande reagens med 0,1% TritonX-100. Den aktiva zonen antikroppen kan uppnås genom utvecklingsstudier Hybridoma Bank (DSHB, http://dshb.biology.uiowa.edu/). Använd en referens antikropp (t.ex. pepparrotsperoxidas-Cy3 konjugat) för att märka NMJ membranet och axoner.
3. Inkubera primära antikroppar vid 4 ° C över natten. Så att torrhet i kylskåpet inte kommer att avdunsta antikroppen lösning, skapa ett fuktkammare genom att sätta lite vatten i botten av en begagnad pipettspets rutan. Täck genomskinligt lock med aluminiumfolie för att minska fluorescerande blekning. Placera dissektion bilden i fuktig kammare och lade hela rutan i 4 ° C inkubator över natten.
4. Nästa morgon, tvätta med PBST (PBS med 0,2% Triton-X-100) 5-10 gånger i 5-10 minuter vardera.
5. Inkubera med sekundär antikropp (t.ex. Invitrogen Alexa get anti-mus-488) spätts i blockerande reagens med 0,1% TritonX-100 i rumstemperatur i 2-4 timmar i den täckta fuktkammare. Inkludera en nukleär färgning (t.ex. DAPI) i den sekundära, om du vill identifiera var kärnan i musklerna eller hjärnan.
6. Tvätta med PBST (PBS med 0,02% Triton-X-100) 5-10 gånger i 5-10 minuter vardera.

5. Montering av Larvernas prover på diabilder:

1. Dekantera och veke av de sista PBST tvätt.
2. Pipettera cirka 1 mL 80% glycerol för att täcka de nålas ner larver skinn.
3. Ta bort 5 av de 6 stiften i alla larver.
4. När du är redo att sätta den första genotyp på en bild tar bort det sista stiftet för alla larver som genotype.
5. Förbered en "tvätta" bilden genom att sätta två droppar av din monteringsmedium på en ren bild. Detta steg är viktigt att tvätta vattenlösning bort larverna för montering och tydligare bilder.
6. Ta en larv i svansen med trubbig pincett, dra larven runt i glycerol och sedan längs torra kanterna på dissekering maträtt, för att ta bort en majoritet av glycerol. Placera larver i första monteringsmedel droppe.
7. Upprepa steg 6 för alla larver av samma genotyp.
8. När alla larver i första monteringsmedium droppe, ta den första larven i svansen och dra det igenom drop och sedan längs torra kanterna av skålen för att ta bort en majoritet av mediet. Placera sedan larver i andra monteringsmedel droppe.
9. Upprepa steg 8 för alla larver med samma genotyp.
10. Förbered din sista bild genom märkning och placera en liten "T" formen på monteringsmedium på bilden.
11. Som i steg 5,8, ta larven i stjärten, dra skinnet genom den andra monteringsmedium droppe och sedan längs torra sidorna av "Tvätta" bild. Efter att majoriteten av mediet har lossnat, placera larver päls på den slutliga bilden i monteringsmedel.
12. Upprepa för alla larver skinn.
13. Se till att alla larver skinn arrangeras som önskat att se till att nagelbanden sidan är nere och den exponerade muskeln är vänd uppåt.
14. Sätt ett lock halka på bilden för att täcka dissekeras larver, med start kanten på den övre raden av "T."
15. Sätt en liten vikt (t ex 9-volts batteri) på omslaget till slip, och se till att monteringsmedium sprider helt under locket halka.
16. För att minska eventuella fluorescerande härdning, placera bilden i en låda eller mörk plats tills monteringsmedel har härdat.
17. Städa upp monteringsmedium som svämmade över den kantade av locket halka. Torka bort överskottet torr monteringsmedium på omslaget halka eller glida med 70% etanol.
18. För att skapa en slutlig tätning, tätning med nagellack.

6. Representativa resultat:

Ett exempel bilden av dissekeras och immunostained larver visas i figur 2. När larverna dissektioner, fläckar och montering görs på rätt sätt kan användaren identifiera larver muskeln av intresse (Figur 3) i segmenten A2-A6. Hoang et al. Ger en detaljerad beskrivning av muskel ställning samt karaktärisering av specifika synaptiska boutons (Hoang och Chiba, 2001). Med hjälp av en hög effekt mål att användaren kan fokusera på en enda synaps och ta z-stack bild. En representant maximal projektion bild av en del av synaps 6 / 7 visas (Figur 4). Sedan använda bildhanteringsprogram kan den aktiva zoner kvantitativt utvärderas för egenskaper som är specifika för din muterade fenotypen. Exempel på funktioner som kan ändras i en viss mutant fenotyp omfattar det totala antalet, flourescence intensitet och avstånd mellan aktiva zoner.

Potentiella fallgropar:

Immunofluorescens utvärdering av larver neuromuskulära förbindelsen är ett värdefullt system som kan ge värdefull insikt i synaptisk biologi, även om det finns potentiella fallgropar som kan begränsa nyttan av detta system. Till exempel, ofta är det önskvärt att bilden färgningsmönstret av två eller flera primära antikroppar i samma prov. Valet av lämpliga primära antikroppar, lämpliga fluoroforer, och lämpliga negativa kontroller är avgörande för framgång.

Om avbildning två antigener i experimentet, vara säker på att den primära antikroppar från olika arter så att varje protein av intresse unikt kan identifieras med ett fluorescerande sekundär antikropp. Ett rekommenderat sätt att minska bakgrunden är att använda en blockerande medel som innehåller det normala serum hos den djurart som den sekundära antikroppar härrör (t.ex. använda vanlig get serum som en blockerande medel vid användning av get-anti-kanin och anti-mus sekundära antikroppar).

Efter att planera de primära och sekundära antikroppar som du kommer att använda i experimentet, måste du också överväga att inkludera kontroller i din färgning set för att säkerställa att den fluorescerande signal som du ser är verkligt och inte bara bakgrund. Om möjligt, inkludera negativa kontrollprover som inte innehåller proteinet av intresse. Detta är lätt gjort i studier av exogena transgenens överuttryck genom att ta med en vild typ djur, men i vissa fall kan åstadkommas med hjälp av en homozygot mutant av din protein av intresse. En annan väsentlig negativ kontroll, användbar för att mäta bakgrundsnivåerna av fluorescerande signal, är att använda sekundär antikropp utan att inkludera det primära. När imaging din resulterar Preps, är det viktigt att förstå att alla de fluorescerande signal som du ser kanske inte riktigt, och kanske bakgrund från yoUR sekundära antikroppar eller endogen vävnad bakgrund. Du kan behöva att normalisera dina bilder att tänka bakgrundsfluorescens när testmetoder för förändringar mellan fluorescensintensiteten.

Val av fluoroforen måste också göras med försiktighet. Prövning av excitation och emissionsspektra för varje fluoroforen och förmåga att unikt identifiera varje signal är avgörande för att undvika att kanalisera blöda igenom. Om det finns någon osäkerhet, ett enkelt sätt att avgöra om omfattningen av blöda igenom är att immunostain med en enda fluoroforen-märkta antikroppar i taget och kontrollera bilden för varje kanal som du kommer att använda i ditt sista experimentet. Detta bör avslöja om blöda igenom sker med mikroskop filter set.

Figur 1. Flödesschema av nagelband skärning och placering av stift 1-6. Klicka här för att visa en större bild

Figur 2. Placering av larver på den slutliga bilden. Se till att larverna Preps utsätts muskler uppåt och nagelband sidan nedåt. Lämna minst en larvkroppen bredd i-mellan varje prov.

Figur 3. Vid avbildning, leta reda på muskler och delar av intresse. Vanliga neuromuskulära korsningar karaktäriseras innerverar muskler 6 / 7, muskler 13, muskel 12, eller muskel 4. På motsatta sidan av den ventrala mittlinjen, det är en spegelbild muskel struktur visas hemi-segmentet. Använd Muscle 31 som en markör för att identifiera vilka segment du avbildning. Bild samma synapserna och segment för resten av dina prover, samla många synaptiska bilder per genotyp som kan användas för kvantifiering.

Figur 4. En representant maximal projektion bild av en del av NMJ innervating muskeln 6 / 7 visas. NC82 (Bruchpilot) färgning visas i grönt. HRP presynaptisk fläck visas i rött. Notera den aktiva zonen punctae som kan ytterligare kvantifieras av bildprogram.

Discussion

För nervceller, är det synaptiska terminalområdet av avgörande betydelse, och är bron för korrekt kommunikation mellan post-och pre-synaptisk celler. Ett kraftfullt sätt att undersöka hälsan hos neuron i sjukdomen modellerna är att analysera proteiner från synaptiska terminalen med immunofluorescens. Den immunofluorescens metod som presenteras här ger forskaren att undersöka många larver samtidigt samtidigt begränsa de miljömässiga skillnader mellan grupper. Det centrala nervsystemet hos Drosophila tredje INSTAR larver har många fördelar, bland annat glutamaterg synapser, kartlagt och upprepade synaptiska terminaler, tillgänglighet, reproducerbarhet och makt genmanipulation. Särskilt i Drosophila neuronala sjukdomar modeller har nivåerna av den aktiva zonen proteinet Bruchpilot ändrats. På grund av det stora antalet larver analyseras samtidigt, gör den aktiva zonen analysen enligt den metod som presenteras forskaren att upptäcka subtila skillnader mellan grupper som kunde återspegla en grundläggande brist i hälso av neuron.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer Base	Dow Corning	68037-59-2	After mixing allow for bubbles to rise slowly out by putting on slow rotator or allowing to sit for 30 minutes or more.
Stainless Steel Minutien PIns	Fine Science Tools	26002-10	Trim to approx. 3-4mm in length with regular scissors
Laminectomy Forceps (Blunt- Used for grasping pins)	Fine Science Tools	11223-20	Use as blunt forceps for grasping pins
Dissection Forceps	World Precision Instruments, Inc.	501985
SuperFine Vannas Scissors, 8cm long	World Precision Instruments, Inc.	501778
Mouse anti-Brp antibody	DSHB	NC82	Use 1:50 dilution
Cy3 Affinipure Goat Anti-Horseradish Peroxidase	Jackson ImmunoResearch	123-165-021	Use at 1:200 dilution
Alexa Fluor 488 Goat anti-Mouse IgG	Invitrogen	A11001	Use approx. 1:200 dilution