Summary
Nöromüsküler bileşke (NMJ)
Abstract
Drosophila larvaları nöromüsküler bileşke (NMJ) sinaptik yapısı ve fonksiyonu çalışma için mükemmel bir model. Drosophila güçlü genetik manipülasyonlar ve larva sinir sisteminin normal işlev sadece eğitim özellikle yararlı değil, aynı zamanda tedirginlikler kolaylığı için iyi bilinir bazı nörolojik hastalığı (Lloyd ve Taylor, 2010) eşlik ediyor. Drosophilia'daki bulunan birçok anahtar sinaptik moleküller de, memeli canlılarda bulunan ve en çok CNS sinaps eksitatör memelilerde olduğu gibi, Drosophila NMJ glutamaterjik ve aktivite bağımlı remodeling (Koh ve ark, 2000 ) gösteriyor. Innervasyonu desen mümkün motor nöronlar ve vücut duvarı kas lifleri arasında bu gibi tespit sinaptik terminalleri, innerve (Keshishian ve Kim, 2004). Çalışma stereotipik ve yineleyici çünkü Ayrıca, Drosophila nöronların tek tek tespit edilebilir , Birlikte genetik ve fiziksel manipülasyon kolaylığı evrimsel olarak korunmuş sinaps bileşenlerinin varlığı sinaptik fonksiyon (Budnik 1996) altında yatan mekanizmaları araştıran Drosophila modeli ideal hale getirir .
Sinaptik terminallerde aktif bölgeleri, bu nörotransmitter serbest siteleri, çünkü özellikle ilgisini çekmektedir. NC82 Drosophila protein Bruchpilot (BRP), aktif bölgesi (Wagh ve ark, 2006) önemli bir bileşeni olan bir CAST1/ERC aile üyesi tanıyan bir monoklonal antikor. BRP doğrudan aktif bölge T-bar şekline ve etkili bir şekilde Ca 2 kümeleme sorumlu + T-bar yoğunluğu altında kanallar (Fouquet ve ark, 2009). BRP, Mutants azalttı Ca 2 + kanal yoğunluğu, depresif uyarılmış vezikül serbest, ve değişen kısa vadeli plastisite (Kittel ve ark, 2006). Drosophila hastalık modellerinde aktif bölgeleri değişiklikler gözlenmiştir. Örneğin, NC82 antikor kullanarak immünofloresan aktif bölge yoğunluğu Amyotrofik lateral skleroz ve Pitt-Hopkins sendromu (. Zweier ve ark, 2009. Ratnaparkhi ve ark, 2008) modelleri azaldığını gösterdi. Böylece, hastalığın Drosophila larvaları modelleri aktif bölgeleri, ya da diğer sinaptik protein, değerlendirilmesi, sinaptik bir kusurun varlığı için değerli bir başlangıç ipucu verebilir.
NMJ immünofloresan analiz için tüm montaj disseke Drosophila larvaları hazırlanması biraz beceri gerektirir, ama en küçük bir uygulama ile bilim adamları tarafından yapılabilir. Sunan her genotip arasında çevresel farklılıklar sınırlayıcı ve tekrarlanabilirlik güven ve istatistiksel analiz için yeterli hayvanların sağlayan, aynı diseksiyon çanak disseke ve immunohistokimyasal olarak birden fazla larva sağlayan bir yöntem.
Protocol
1. İmmünofloresan için hazırlanması:
- Diseksiyon bir yüzey oluşturmak için, küçük bir doku kültürü plaka Sylgard 184 Silikon Elastomer Base dökün. Tamamen disseksiyon alanında jant daha düşük olduğunu plaka doldurmak için değil emin olun.
- Diseksiyonu pimleri manipülasyon artan kolaylığı için yaklaşık 3,5 mm uzunluğunda kesin ve larva başına en az 6 pin olduğundan emin olun.
- Künt forseps diseksiyon için pimleri kavramak için izin gerekecek.
2. Larva, Diseksiyon:
- Flakonun kenarlara sürünerek ve pupa için henüz başlamamıştır üçüncü instar larvaları dolaşıp seçin.
- Bir larva, bir stereomikroskopta altında diseksiyon yüzey üzerine yerleştirin. Uzak bir Kimwipe kullanarak aşırı nemli Wick.
- Her larva dorsal yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Larvaların dorsal kenarı boyunca iki trakea, beyaz çizgiler görmek mümkün olacak. Dorsal orta hat işaretleri çünkü ortada merkezi bu mümkün olduğunca deneyin.
- Sadece ağız kanca üzerinde Yeri pin # 1 (Şekil 1).
- Sadece trakea arasındaki spiracles yukarıdaki kuyruk pin # 2 yerleştirin.
- Manikür kurumasını önlemek için küçük bir miktar larva PBS ekleyin.
- Genotipleri her genotip arasında bir iğne koyarak mekansal ayrıldığından emin, tüm larvaları ile yukarıdaki adımları tekrarlayın.
- Tracheas (Şekil 1) hem genelinde pin # 2 üzerinde bir küçük enine kesilmiş sağ olun.
- Geçmiş pin up tracheas arasındaki dorsal orta hat boyunca ilk kes ve kesim yolu # 1 makas yerleştirin.
- Sağ ve sol taraf manikür çekerek onları aşağı pin izin açılacaktır böylece, manikür her tarafında en üst ve altındaki diğer küçük kesikler yapmak gerekecektir.
- Place pin # 3, 4, 5, ve her köşesinde az 6.
- Oda sıcaklığında 20-25 dakika süreyle% 4 PFA örnek Fix
- PFA Durusu ve her zaman şişeden, PBS 3-4 kez yıkayın.
3. Doku Temizleme:
- Genellikle beynin bulunduğu bölgeyi korumak için istiyorum çünkü posterior sonunda dokularda kaldırarak başlayın.
- Steromicroscope kullanarak ve PBS bir damla altında larvaları, ilk trakea arka ucunu yakala ve onunla birlikte yağ vücudun bazı kaldırabilir çekin iken. Ikinci trakea için tekrarlayın.
- Bazı posterior yağ vücut veya bağırsak alın ve onları hazırlık çekin. Posterior dokusunun en kaldırıldıktan sonra, beyin etrafındaki küçük dokular kaldırarak odaklanmak. Kaslar, veya NMJ morfolojisi sadece meraklı iseniz, aynı zamanda beyin kaldırabilirsiniz.
- Kas 31, karın segment yönlendirmesi için yararlı bir belirteç daha iyi bir görünüm için beyin kaldırılması sağlar.
4. Aktif Bölgeleri için İmmünofloresan:
- Diseksiyon çanak disseke preparatlarıyla engelleme ajan (PBS içinde% 5 Normal Keçi Serum) ekleyin. Oda sıcaklığında 1 saat süreyle engelleyin. Sadece dilüsyonları engelleme ve antikor için bir çözüm yapmak istiyorsanız,% 0.1 TritonX-100 - doku permeabilization için bloke edici ajanlar içerir.
- % 0.1 TritonX-100 ile reaktif engelleme seyreltilmiş İlköğretim antikor uygulayın. Aktif bölge antikor Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası (DSHB, http://dshb.biology.uiowa.edu/) aracılığıyla ulaşılabilir. NMJ membran ve aksonlar etiket (örneğin horseradish peroksidaz-Cy3 konjuge) referans antikor kullanın.
- 4 ° C gecede primer antikorlar inkübe edin. Buzdolabı kuruluk antikor çözüm buharlaşması, böylece kullanılan pipet kutusunun alt kısmında bir miktar su koyarak bir nem odası oluşturun. Floresan beyazlatma azaltmak için saydam kapak alüminyum folyo ile örtün. Nem odasında diseksiyonu slayt yerleştirin ve bir gecede 4 ° C inkübatör tüm kutusu koymalı.
- Ertesi sabah, PBST (% 0.2 Triton X-100 ile PBS), her biri için 5-10 dakika 5-10 kat ile yıkayın.
- Sekonder antikoru (anti-Mouse-488) kapalı nem odasında 2-4 saat boyunca oda sıcaklığında% 0.1 TritonX-100 ile reaktif engelleme seyreltilmiş örneğin Invitrogen Alexa Keçi ile inkübe edin. Ikincil (örneğin DAPI) bir nükleer leke dahil, kas veya beyin çekirdeğin konumunu belirlemek istiyorsanız.
- PBST (% 0,02 Triton X-100 ile PBS) ile 5-10 dakika her biri için 5-10 kez yıkayın.
5. Slaytlar Larvaların Örnekleri Montaj:
- Durusu ve son PBST yıkama fitil.
- Aşağı tuş larva postlarını kapsayacak şekilde Pipet yaklaşık 1 ml% 80 gliserol.
- Tüm larvaları 6 pin 5 çıkarın.
- Bu genoty tüm larvaları için son pin kaldırmak bir slayt üzerindeki ilk genotip koymak için hazır olduğunuzdape.
- Temiz bir slayt montaj orta iki damla koyarak bir "yıkama" slayt hazırlayın. Bu adım, montaj ve net görüntü için larva kapalı su solüsyonu yıkamak için önemlidir.
- Gliserol çoğunluğu kaldırmak için, künt forseps ile kuyruk bir larva tut larva gliserol etrafında sürükleyin ve sonra diseksiyon yemeğin kuru kenarlarında. Ilk montaj orta açılan larva yerleştirin.
- Aynı genotip larvaları için 6. adımı tekrarlayın.
- Bir kez tüm larvaları ilk montaj orta açılan, kuyruk tarafından ilk larva kapmak ve orta çoğunluğu kaldırmak için daha sonra yemeğin kuru kenarlarında açılan ve çekin. Sonra ikinci montaj orta açılan larva yerleştirin.
- Aynı genotip ile tüm larvaları için adım 8 tekrarlayın.
- Etiketleme ve slayt üzerinde montaj orta küçük bir "T" şeklinde yerleştirerek son slayt hazırlayın.
- Adım 5.8 olduğu gibi, kuyruk larva kapmak; ile postu kuru kenarları boyunca "Yıkama" slayt sonra ikinci montaj orta bırak ve çekin. Çoğunluğu orta gelir sonra montaj orta son slaytta larva postu yerleştirin.
- Tüm larva postlarını için tekrarlayın.
- Tüm larva postlarını manikür tarafı aşağı yukarı bakacak şekilde ve açıkta kalan kas olduğunu emin olun istenilen düzenlenmiş olduğunu emin olun.
- "T" üst satırında başlangıç kenarı ile disseke larvaları karşılamak için slayt üzerinde bir kapak kayma yerleştirin
- Montaj orta kapak kayma altında tamamen yayılır emin kapak kayma küçük bir ağırlık koyun (örneğin 9 voltluk pil).
- Mümkün floresan su verme azaltmak için, bir çekmece veya koyu alan slayt montaj orta kürünü tamamlayana kadar yerleştirin.
- Kapak kayma kenarlı taştı montaj orta temizleyin. % 70 etanol ile kapak kayma veya slayt aşırı kuru montaj orta temizleyin.
- Tırnak cilası ile mühür, son bir mühür oluşturmak için.
6. Temsilcisi Sonuçlar:
Disseke ve immunohistokimyasal larvaları bir örnek slayt Şekil 2'de gösterilmiştir. Larvaları diseksiyonları, lekeler ve montaj düzgün yapılmazsa, kullanıcı segmentleri A2-A6 ilgi larvaları kas (Şekil 3) tespit edebilir. Hoang ve ark. Kas pozisyonu ayrıntılı tanımlarının yanı sıra belirli sinaptik BOUTONS (Hoang ve Chiba, 2001) karakterizasyonu sağlar. Yüksek güç bir hedef kullanarak kullanıcı tek bir sinaps odaklanmak ve z-yığın görüntü alabilir. 6 / 7 sinaps bir kısmını bir temsilcisi maksimum projeksiyon görüntü (Şekil 4) gösterilmiştir. Sonra, aktif bölgeleri görüntüleme yazılımı kullanarak kantitatif özellikle mutant fenotip özellikleri değerlendirilir olabilir. Belirli bir mutant fenotip değişmiş olabilir özellikler örnek olarak aktif bölgeleri arasındaki toplam sayısı, flöresan şiddeti ve aralık içerir.
Potansiyel Tuzaklar:
Larva nöromüsküler kavşak immünofloresan değerlendirme değerli bir sistem, bu sistemin yararı sınırı potansiyel tuzaklar olmasına rağmen, sinaptik biyoloji değerli öngörüler sağlayabilir. Örneğin, sık sık aynı örnek iki veya daha fazla primer antikor boyama desen, görüntünün arzu edilen bir durumdur. Uygun birincil antikorlar, uygun fluorophores ve uygun negatif kontroller seçim başarısı için önemlidir.
Denemeniz görüntüleme iki antijen varsa, birincil antikorlar ilgi her protein benzersiz bir floresan etiketli sekonder antikoru ile tespit edilebilir, böylece farklı türler olduğundan emin olun. Arka plan azaltmak için önerilen yol, ikincil antikorlar (keçi anti-tavşan ya da anti-fare sekonder antikor kullanarak örneğin engelleyici bir ajan olarak normal keçi serumu kullanın) elde edildiği türlerin normal içeren serum engelleyici bir ajan kullanmak.
Denemenizi kullanacağı birincil ve ikincil antikorlar planlama sonra, kontrolleri dahil olmak üzere sizin boyama de düşünmek gerekir Gördüğünüz floresan sinyal gerçek ve sadece arka plan olmasını sağlamak için ayarlar. Mümkünse, ilgi protein içermeyen negatif kontrol örnekleri yer alıyor. Bu kolay eksojen transgen aşırı ekspresyonu çalışmaları, vahşi bir hayvan da dahil olmak üzere tarafından yapılır, ancak bazı durumlarda sizin ilgi protein homozigot mutant kullanılarak yapılabilir. Floresan sinyal arka plan düzeylerini ölçmek için yararlı bir diğer önemli negatif kontrolü, birincil dahil olmak üzere ikincil antikor kullanmaktır. Zaman görüntüleme çıkan preparatlarıyla, gördüğünüz floresan sinyal tüm gerçek olmayabilir anlamak için önemlidir ve yo arka olabilirur ikincil antikor veya endojen doku arka plan. Floresan arasındaki değişiklikleri assaying yaparken arka plan floresan dikkate resimleri normalleştirmek için gerekebilir.
Fluorofor seçimi dikkatli yapılmalıdır. Eksitasyon ve emisyon spektrumları her fluorofor ve her sinyali tespit etmek için benzersiz yeteneği göz önünde bulundurulması ile kanal kanama önlemek için şarttır. Herhangi bir belirsizlik, ile kanama ölçüde bir seferde tek bir fluorofor etiketli antikor immunostain ve son deney kullanarak olacağını, her bir kanal ile görüntü kontrol olup olmadığını belirlemek için basit bir yol var. Yoluyla kanama mikroskop filtre seti ile oluşup oluşmadığını Bu açığa çıkarmalıdır.
Şekil 1 kütikula kesme ve yerleştirme pimleri 1-6 Akış şeması , daha büyük bir resim görmek için buraya tıklayın
Şekil 2 final slayt larvaların Yerleştirme. Larvaları preparatlarıyla kas tarafında aşağı maruz kalan ve manikür tarafında olduğunu emin olun. Her bir numune arasında en az bir larva gövde genişliği bırakın.
Şekil 3. Görüntüleme, ilgi kas ve segmentleri bulmak. Ortak nöromüsküler kavşakları innerve kaslar 6 / 7, 13 kas, kas 12, ya da kas 4 karakterizedir. Ventral orta hat karşı tarafta gösterilen hemi-segment bir ayna görüntüsü kas yapısı yoktur. Size görüntüleme hangi kesimi tanımlamak için bir belirteç olarak 31 Kas kullanın. Ölçümü için kullanılabilir genotip başına birçok sinaptik görüntü toplama Görüntü örneklerin geri kalanı için aynı sinaps ve segmentleri.
Şekil 4, NMJ innerve kas 6 / 7 bir kısmı bir temsilci maksimum projeksiyon görüntüsü gösterilir . NC82 (Bruchpilot) boyama yeşil gösterilir. Kırmızı leke HRP presinaptik gösterilmiştir. Daha fazla görüntüleme yazılımı ile belirlenebilir aktif bölge punctae unutmayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nöronlar için, sinaptik terminal alanında kritik öneme sahip ve post ve pre-sinaptik hücreleri arasında doğru iletişim için köprü. Nöronun sağlık hastalık modelleri araştırmak için güçlü bir şekilde immünofloresan sinaptik terminal protein analiz etmektir. Burada sunulan immünofloresan yöntemi gruplar arasında çevresel farklılıklar sınırlandırarak araştırmacı aynı anda birçok larva incelemek sağlar. Drosophila üçüncü instar larvaları merkezi sinir sistemi glutamaterjik sinaps, eşlenen ve tekrarlanan sinaptik terminalleri, erişilebilirlik, tekrarlanabilirlik ve genetik manipülasyon gücü de dahil olmak üzere pek çok avantajı vardır. Özellikle Drosophila nöron hastalığı modelleri, aktif bölge protein Bruchpilot düzeyleri değişmiş oldu. Larvaların çok sayıda aynı anda test Çünkü, sunulan yöntem kullanarak aktif bölge analizi nöronun sağlık alanında temel bir kusur yansıtabilecek gruplar arasındaki ince farkları tespit etmek için araştırmacı sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Dr. Nael Alami ve Dr. Nam Chul Kim bu el yazması konusunda yararlı yorumlar için teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Base | Dow Corning | 68037-59-2 | After mixing allow for bubbles to rise slowly out by putting on slow rotator or allowing to sit for 30 minutes or more. |
| Stainless Steel Minutien PIns | Fine Science Tools | 26002-10 | Trim to approx. 3-4mm in length with regular scissors |
| Laminectomy Forceps (Blunt- Used for grasping pins) | Fine Science Tools | 11223-20 | Use as blunt forceps for grasping pins |
| Dissection Forceps | World Precision Instruments, Inc. | 501985 | |
| SuperFine Vannas Scissors, 8cm long | World Precision Instruments, Inc. | 501778 | |
| Mouse anti-Brp antibody | DSHB | NC82 | Use 1:50 dilution |
| Cy3 Affinipure Goat Anti-Horseradish Peroxidase | Jackson ImmunoResearch | 123-165-021 | Use at 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-Mouse IgG | Invitrogen | A11001 | Use approx. 1:200 dilution |
References
- Budnik, V. Synapse maturation and structural plasticity at Drosophila neuromuscular junctions. Curr Opin Neurobiol. 6, 858-867 (1996).
- Fouquet, W., Owald, D., Wichmann, C., Mertel, S., Depner, H., Dyba, M., Hallermann, S., Kittel, R. J., Eimer, S., Sigrist, S. J. Maturation of active zone assembly by Drosophila Bruchpilot. J Cell Biol. 186, 129-145 (2009).
- Hoang, B., Chiba, A. Single-Cell Analysis of Drosophila Larval Neuromuscular Synapses. Developmental Biology. 229, 55-70 (2001).
- Keshishian, H., Kim, Y. -S. Orchestrating development and function: retrograde BMP signaling in the Drosophila nervous system. Trends in Neurosciences. 27, 143-147 (2004).
- Kittel, R. J., Wichmann, C., Rasse, T. M., Fouquet, W., Schmidt, M., Schmid, A., Wagh, D. A., Pawlu, C., Kellner, R. R., Willig, K. I., Hell, S. W., Buchner, E., Heckmann, M., Sigrist, S. J. Bruchpilot Promotes Active Zone Assembly, Ca2+ Channel Clustering, and Vesicle Release. Science. 312, 1051-1054 (2006).
- Koh, Y. H., Gramates, L. S., Budnik, V. Drosophila larval neuromuscular junction: Molecular components and mechanisms underlying synaptic plasticity. Microscopy Research and Technique. 49, 14-25 (2000).
- Lloyd, T. E., Taylor, J. P. Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease. Ann N Y Acad Sci. 1184, e1-e20 (2010).
- Ratnaparkhi, A., Lawless, G. M., Schweizer, F. E., Golshani, P., Jackson, G. R. A Drosophila model of ALS: human ALS-associated mutation in VAP33A suggests a dominant negative mechanism. PLoS One. 3, e2334-e2334 (2008).
- Wagh, D. A., Rasse, T. M., Asan, E., Hofbauer, A., Schwenkert, I., Dürrbeck, H., Buchner, S., Dabauvalle, M. -C., Schmidt, M., Qin, G., Wichmann, C., Kittel, R., Sigrist, S. J., Buchner, E. Bruchpilot, a Protein with Homology to ELKS/CAST, Is Required for Structural Integrity and Function of Synaptic Active Zones in Drosophila. Neuron. 49, 833-844 (2006).
- Zweier, C., Jong, E. K. de, Zweier, M., Orrico, A., Ousager, L. B., Collins, A. L., Bijlsma, E. K., Oortveld, M. A., Ekici, A. B., Reis, A., Schenck, A., Rauch, A. CNTNAP2 and NRXN1 are mutated in autosomal-recessive Pitt-Hopkins-like mental retardation and determine the level of a common synaptic protein in Drosophila. Am J Hum Genet. 85, 655-666 (2009).
