La disección y la imagen de zonas activas en el Drosophila La unión neuromuscular

Summary

La unión neuromuscular (UNM) de

Abstract

La Drosophila larvas de la unión neuromuscular (UNM) es un excelente modelo para el estudio de la estructura y la función sináptica. Drosophila es bien conocido por la facilidad de manipulación genética de gran alcance y el sistema nervioso de larvas ha demostrado ser particularmente útil para estudiar no sólo la función normal, sino también las perturbaciones que acompañan a algunas enfermedades neurológicas (Lloyd y Taylor, 2010). Muchas moléculas clave sináptica en Drosophila también se encuentran en los mamíferos y como la mayoría de las sinapsis excitadoras del SNC en los mamíferos, la Drosophila NMJ es glutamatérgica y demuestra dependiente de la actividad de remodelación (Koh et al., 2000). Además, las neuronas de Drosophila pueden ser identificados individualmente, porque sus patrones de inervación son estereotipados y repetitivos que permiten al estudio identificó las terminales sinápticas, como las que existen entre las neuronas motoras y las fibras musculares de la pared del cuerpo que inervan (Keshishian y Kim, 2004). La existencia de los componentes de la sinapsis conservado evolutivamente, junto con la facilidad de manipulación genética y física que el modelo de Drosophila ideal para investigar los mecanismos subyacentes a la función sináptica (Budnik, 1996).

Las zonas activas en las terminales sinápticas son de particular interés debido a que estos son los sitios de liberación de neurotransmisores. NC82 es un anticuerpo monoclonal que reconoce la proteína de Drosophila Bruchpilot (BRP), un miembro de la familia CAST1/ERC que es un componente importante de la zona activa (Wagh et al., 2006). BRP ha demostrado que la forma directa de la zona activa T-bar y es responsable de manera efectiva la agrupación Ca ^{2 +} canales por debajo de la densidad de T-bar (Fouquet et al., 2009). Los mutantes de BRP han reducido la densidad de Ca ^{2 +} canal, deprimido liberación evocada vesícula, y la alteración a corto plazo plasticidad (Kittel et al., 2006). Alteraciones en las zonas activas se han observado en modelos de enfermedad de Drosophila. Por ejemplo, la inmunofluorescencia con el anticuerpo NC82 mostraron que la densidad de la zona activa se redujo en los modelos de la esclerosis lateral amiotrófica y el síndrome de Pitt-Hopkins (Ratnaparkhi et al, 2008;. Zweier et al, 2009).. Por lo tanto, la evaluación de las zonas activas, o de otras proteínas sinápticas, en los modelos de las larvas de Drosophila de la enfermedad pueden proporcionar una valiosa pista inicial a la presencia de un defecto sináptica.

La preparación de todo el montaje disecados larvas de Drosophila para el análisis de inmunofluorescencia de la UNM requiere cierta habilidad, pero se puede lograr por la mayoría de los científicos con un poco de práctica. Que se presenta es un método que ofrece para las larvas de varios de ser diseccionado y immunostained en el plato de la disección mismo, lo que limita las diferencias ambientales entre cada genotipo y proveer suficientes animales para la confianza en la reproducibilidad y el análisis estadístico.

Protocol

1. Preparación para la inmunofluorescencia:

1. Para crear una superficie de disección, vierta Sylgard 184 Base de elastómero de silicona en una placa de cultivo de tejidos pequeños. Asegúrese de no llenar completamente la placa para que el área de disección es menor que la llanta.
2. Trim pines disección de una longitud aproximada de 3,5 mm para una mayor facilidad de manipulación, y asegúrese de tener al menos 6 pines por larva.
3. Usted necesitará unas pinzas contundente que le permitirá a usted comprender los pines para la disección.

2. La disección de las larvas:

1. Seleccione vagando larvas de tercer estadio que se están arrastrando a los lados del vial y no han comenzado a convertir en ninfas.
2. Colocar una larva en la superficie de la disección bajo un microscopio estereoscópico. Evacuación de la húmeda el exceso de uso de un Kimwipe.
3. Organizar cada larva por lo que la parte dorsal hacia arriba. Usted será capaz de ver dos tráquea, líneas blancas a lo largo de la cara dorsal de las larvas. Trate de centrar estas en el medio tanto como sea posible, porque esto marca la línea media dorsal.
4. Colocar el pin # 1 justo por encima de los ganchos de la boca (Figura 1).
5. Colocar el pin # 2 en la cola justo por encima de los espiráculos entre las tráqueas.
6. Agregue una pequeña cantidad de PBS a las larvas para evitar la desecación de la cutícula.
7. Repita los pasos anteriores con todas las larvas, asegurándose de que los genotipos están separados espacialmente mediante la colocación de un alfiler entre cada genotipo.
8. Gire a la derecha pequeño corte transversal sobre el pin # 2 a través de ambas tráqueas (Figura 1).
9. Inserte sus tijeras en el primer corte y corte a lo largo de la línea media dorsal entre la tráquea hasta el final hasta pasados ​​pin # 1.
10. Usted tendrá que hacer otros pequeños cortes en la parte inferior y superior de cada lado de la cutícula, por lo que la izquierda ya la derecha se abrirá lo que le permite precisar sin tirar de la cutícula.
11. Colocar el pin # 's 3, 4, 5 y 6 en cada esquina.
12. Fijar la muestra con 4% PFA durante 20-25 minutos a temperatura ambiente
13. Decantar la PFA y enjuague con PBS 3.4 veces, la decantación cada vez.

3. Extracción de tejido:

1. Comience por quitar los tejidos en el extremo posterior, porque por lo general quiere proteger la zona donde se encuentra el cerebro.
2. Mientras se utiliza un steromicroscope y con las larvas en una gota de PBS, en primer lugar tomar el extremo posterior de una de la tráquea y tire de ella que puede eliminar algunas de las grasas de cuerpo con él. Repita el procedimiento para la tráquea segundos.
3. Coge un poco de la parte posterior del cuerpo la grasa o el intestino y sacarlos de la preparación. Una vez que la mayoría de los tejidos posterior se ha eliminado, se centran en la eliminación de los tejidos que rodean el cerebro pequeño. Si usted está interesado sólo en los músculos, o la morfología de la UNM se puede quitar el cerebro.
4. Extracción del cerebro que permite una mejor visualización del músculo 31, que es un marcador útil para la orientación del segmento abdominal.

4. Inmunofluorescencia para zonas activas:

1. Añadir agente de bloqueo (5% suero normal de cabra en PBS) a las preparaciones de disección en el plato de la disección. Bloque durante 1 hora a temperatura ambiente. Si usted desea hacer una única solución para el bloqueo y las diluciones de anticuerpos, son un 0,1% TritonX-100 a su agente de bloqueo para la permeabilización de los tejidos.
2. Aplicar el anticuerpo primario diluido en el bloqueo de reactivo con el 0,1% TritonX-100. El anticuerpo zona activa es alcanzable a través del desarrollo Estudios del Banco hibridoma (DSHB, http://dshb.biology.uiowa.edu/). El uso de un anticuerpo de referencia (por ejemplo, peroxidasa de rábano-Cy3 conjugada) para marcar la membrana MNJ y los axones.
3. Incubar los anticuerpos primarios a 4 ° C durante la noche. Así que la sequedad de la nevera no se evapora la solución de anticuerpos, crear una cámara de humedad, poniendo un poco de agua en el fondo de una caja de pipeta utilizada. Cubra la tapa transparente con papel de aluminio para reducir el fluorescente de blanqueo. Colocar la placa de disección en la cámara húmeda y poner toda la caja en la incubadora de 4 ° C durante la noche.
4. A la mañana siguiente, lavar con PBST (PBS con 0,2% Triton-X-100) 5-10 veces durante 5-10 minutos cada uno.
5. Incubar con el anticuerpo secundario (por ejemplo, Invitrogen Alexa cabra anti-ratón-488) diluido en el bloqueo de reactivo con el 0,1% TritonX-100 a temperatura ambiente durante 2-4 horas en la cámara de humedad cubiertos. Incluyen una mancha nuclear (por ejemplo, DAPI) en el secundario, si desea identificar la ubicación de los núcleos en los músculos o el cerebro.
6. Lavar con PBST (PBS con 0,02% Triton-X-100) 5-10 veces durante 5-10 minutos cada uno.

5. Montaje de las muestras de las larvas de las diapositivas:

1. Decantar y la mecha de la lava PBST pasado.
2. Pipeta de 80% de glicerol de aproximadamente 1 ml para cubrir las pieles inmovilizado larval.
3. Retire 5 de los 6 pines en todas las larvas.
4. Cuando esté listo para poner el primer genotipo en un portaobjetos de quitar el pasador de una duración de todas las larvas que genotype.
5. Prepare un "lavado" de diapositivas por poner dos gotas de su medio de montaje sobre un portaobjetos limpio. Este paso es importante lavar la solución de agua de las larvas para el montaje y la más clara imagen.
6. Agarra una larva por la cola con su pinza roma, arrastre la larva en todo en el glicerol y luego a lo largo de los bordes secos de su plato de disección, para eliminar la mayoría de los triglicéridos. Coloque las larvas en el descenso medio del primer montaje.
7. Repita el paso 6 para todas las larvas del mismo genotipo.
8. Una vez que todas las larvas se encuentran en el descenso medio del primer montaje, toma la larva en primer lugar por la cola y tire de ella a través de la caída y después a lo largo de los bordes del plato seco para eliminar la mayoría de los medios. A continuación, coloque las larvas en la caída de segundo medio de montaje.
9. Repita el paso 8 para todas las larvas con el mismo genotipo.
10. Prepare su última diapositiva, mediante el etiquetado y la colocación es una pequeña "T" de medio de montaje en la diapositiva.
11. Como en el paso 5.8, toma la larva por la cola, tire de la piel a través de la caída de segundo medio de montaje y luego a lo largo de los lados de la seca "lavado" de diapositivas. Después de que la mayoría de los medianos ha salido, colocar la piel de las larvas en la diapositiva final en el medio de montaje.
12. Repita para todas las pieles de las larvas.
13. Asegúrese de que todas las pieles de las larvas están dispuestas como se desee asegurarse de que el lado de la cutícula se ha reducido y el músculo está expuesto hacia arriba.
14. Coloque una hoja de cubierta de la diapositiva para cubrir las larvas disecadas, con el borde de partida en la línea superior de la "T"
15. Ponga un peso pequeño (por ejemplo, batería de 9 voltios) en la hoja de la cubierta, asegurándose de que el medio de montaje se extiende por completo bajo el cubreobjetos.
16. Para reducir el enfriamiento fluorescentes es posible, colocar la placa en un cajón o un espacio oscuro hasta el medio de montaje se ha curado.
17. Limpiar el medio de montaje que se desbordó el filo de la hoja de la cubierta. Limpie el exceso de medio de montaje en seco de la hoja de la cubierta o de diapositivas con etanol al 70%.
18. Para crear un sello final, sellado con esmalte de uñas.

6. Los resultados representativos:

Un ejemplo de diapositivas de las larvas de disección y immunostained se muestra en la Figura 2. Cuando la disección de las larvas, las manchas, y el montaje se hace correctamente, el usuario puede identificar el músculo larvas de interés (Figura 3) en los segmentos A2-A6. Hoang et al. Proporciona una descripción detallada de la posición de los músculos, así como la caracterización de determinados botones sinápticos (Hoang y Chiba, 2001). Utilizando un objetivo de alta potencia que el usuario pueda concentrarse en una sola sinapsis y tomar z-stack de la imagen. Un máximo representante de la imagen de proyección de una parte de la sinapsis 6.7 se muestra (Figura 4). Luego, utilizando el software de imágenes, las zonas activas pueden ser evaluados cuantitativamente para las características que son propias de su fenotipo mutante. Ejemplos de características que pueden estar alterados en un fenotipo mutante particular, la cantidad total, la intensidad de fluorescencia, y el espaciamiento entre las zonas activas.

Errores potenciales:

Evaluación de inmunofluorescencia de la unión neuromuscular larvaria es un valioso sistema que puede proporcionar información valiosa sobre la biología sináptica, aunque existen riesgos potenciales que pueden limitar la utilidad de este sistema. Por ejemplo, con frecuencia es conveniente para la imagen del patrón de tinción de dos o más anticuerpos primarios en la misma muestra. La elección apropiada de anticuerpos primarios, fluoróforos adecuados y apropiados controles negativos es esencial para el éxito.

Si dos antígenos de imágenes en su experimento, asegúrese de que los anticuerpos primarios son de diferentes especies para que cada proteína de interés puede ser identificada con un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia. Un método recomendado para reducir el fondo es el uso de un agente de bloqueo que contiene el suero normal de la especie de la que los anticuerpos secundarios se obtuvieron (por ejemplo, el uso de suero normal de cabra como un agente de bloqueo cuando se utiliza de cabra anti-conejo o anti-ratón secundaria de anticuerpos).

Después de la planificación de los anticuerpos primarios y secundarios que va a utilizar en su experimento, también se debe considerar la inclusión de los controles de la tinción de conjuntos para asegurar que la señal fluorescente que está viendo es real y no sólo de fondo. A ser posible, muestras de control negativo que no contienen la proteína de interés. Esto se hace fácilmente en los estudios de la sobreexpresión de los transgenes exógenos mediante la inclusión de un animal silvestre, pero en algunos casos se puede lograr mediante el uso de un mutante homocigota de la proteína de interés. Otro control esencial negativo, útil para medir los niveles de fondo de la señal fluorescente, es utilizar el anticuerpo secundario, sin incluir las primarias. Cuando la imagen de su prepara resultante, es importante entender que todos los de la señal fluorescente que estamos viendo no puede ser real, y podría ser el fondo del your anticuerpos secundarios o de fondo del tejido endógeno. Es posible que necesite para normalizar las imágenes a considerar la fluorescencia de fondo cuando analizando los cambios entre la intensidad de la fluorescencia.

Elección de fluoróforo también debe hacerse con cuidado. Consideración de la excitación y el espectro de emisión de cada fluoróforo y la capacidad de detectar de forma única cada señal es esencial para evitar sangrar a través de los canales. Si hay alguna duda, una forma sencilla de determinar si la extensión de la sangre a través de es inmunotinción con un único fluoróforo anticuerpo marcado a la vez y ver la imagen con cada canal que va a utilizar en el experimento final. Esto debe revelar si el sangrado se produce a través de su aparato de filtro microscopio.

Figura 1. Diagrama de flujo de cortar la cutícula y la colocación de los clavos 1-6. Haga clic aquí para ver una imagen más grande

Figura 2. Colocación de las larvas en la diapositiva final. Asegúrese de que las preparaciones de las larvas están expuestos los músculos laterales y laterales cutícula hacia abajo. Deje por lo menos un ancho de cuerpo de la larva en cada muestra.

Figura 3. Cuando la imagen, localizar los músculos y los segmentos de interés. Común la unión neuromuscular caracterizado inervan los músculos de 6 / 7, 13 músculos, 12 músculos, o el músculo 4. En el lado opuesto de la línea media ventral, que es una imagen especular de la estructura muscular de la muestra hemi-segmento. Uso de los músculos 31 como un marcador para identificar a qué segmento está la imagen. Imagen de las mismas sinapsis y segmentos para el resto de sus muestras, recogiendo muchas imágenes sináptica por genotipo que puede ser utilizado para la cuantificación.

Figura 4. Una imagen de proyección máxima representante de una porción del músculo NMJ inervan 07.06 se muestra. NC82 (Bruchpilot) tinción se muestra en verde. HRP mancha pre-sináptica se muestra en rojo. Tenga en cuenta la punctae zona activa que puede ser cuantificados por el software de imágenes.

Discussion

Para las neuronas, la zona de la terminal sináptica es de vital importancia, y es el puente para la correcta comunicación entre el puesto y las células pre-sináptica. Una forma poderosa para investigar la salud de las neuronas en modelos de enfermedad es analizar las proteínas de la terminal sináptica por inmunofluorescencia. El método de inmunofluorescencia que aquí se presenta permite al investigador para examinar las larvas de manera simultánea al tiempo que limita las diferencias ambientales entre los grupos. El sistema nervioso central de Drosophila larvas de tercer estadio tiene muchas ventajas, entre las sinapsis glutamatérgicas, mapas y repetidas terminales sinápticas, la accesibilidad, la reproducibilidad y el poder de la manipulación genética. Específicamente en los modelos de Drosophila enfermedad neuronal, los niveles de la proteína activa zona Bruchpilot ha sido alterado. Debido a la gran cantidad de larvas ensayadas al mismo tiempo, el análisis de la zona activa con el método presentado permite al investigador para detectar diferencias sutiles entre los grupos, que podrían reflejar un defecto fundamental en la salud de la neurona.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer Base	Dow Corning	68037-59-2	After mixing allow for bubbles to rise slowly out by putting on slow rotator or allowing to sit for 30 minutes or more.
Stainless Steel Minutien PIns	Fine Science Tools	26002-10	Trim to approx. 3-4mm in length with regular scissors
Laminectomy Forceps (Blunt- Used for grasping pins)	Fine Science Tools	11223-20	Use as blunt forceps for grasping pins
Dissection Forceps	World Precision Instruments, Inc.	501985
SuperFine Vannas Scissors, 8cm long	World Precision Instruments, Inc.	501778
Mouse anti-Brp antibody	DSHB	NC82	Use 1:50 dilution
Cy3 Affinipure Goat Anti-Horseradish Peroxidase	Jackson ImmunoResearch	123-165-021	Use at 1:200 dilution
Alexa Fluor 488 Goat anti-Mouse IgG	Invitrogen	A11001	Use approx. 1:200 dilution