Summary
我々は、実証
Abstract
中脳へのRGC予測の対象指定と洗練は、開発時に神経接続の形態の方法正確なパターンを研究するための一般的かつ強力なモデルシステムです。マウスでは、retinofugal予測は、地形的および視床と上丘（SC）の外側膝状核（dLGN）でフォームの眼特異層に配置されています。 retinofugal突 起のこれらの正確なパターンの開発は、典型的には、西洋ワサビペルオキシダーゼ1〜4と蛍光色素およびトレーサーとRGCsの集団を、標識することにより研究されている。しかし、これらの方法は、網膜部位の地図形成の根拠となる個々のRGC軸索のあずまや形態の発達的変化への洞察を提供するために、あまりにも粗いです。彼らはまた、RGCsの遺伝子操作のために許可されていません。
最近、エレクトロポレーションは、網膜5月11日に荷電分子を送達するための正確な空間的、時間的な制御を提供するための効果的な方法となっています。現在の網膜エレクトロポレーションプロトコルは、遺伝子操作が可能で、出生後のマウスのRGCsの単一または少数のクラスタのretinofugal予測のトレースをしないでください。それは 、in vivo エレクトロポレーションで生後は標識効率が極めて低いためRGCsをトランスフェクションするための実行可能な方法ではない、したがって、RGC前駆細胞の分化と増殖6を受けている胚の年齢でターゲティングが必要と主張されています。
このビデオでは、標的遺伝子の配信、shRNAを、そして出産後マウスRGCsに蛍光デキストランのためのin vivoエレクトロポレーションプロトコルで説明します。この手法は、分岐、ラミネーション、再生および回路の開発の様々な段階におけるシナプス形成、軸索の退縮を含む神経発達のいくつかの側面に関与候補遺伝子の効率的なスクリーニングのための迅速で効果的なコストかつ比較的容易にプラットフォームを提供します。要約すると我々はここで知覚マップの開発の根底にある分子メカニズムのさらなる洞察を提供する貴重なツールについて説明します。
Protocol
1。セットアップエレクトロポレーション用の機器
- 電極 ：我々は、電極として使用するデュモン＃5鉗子を変更した。
- 鉗子を分離し、分解します。
- 各芯の広い端に半田線。電線接続されていると絶縁テープで先端部が露出突起の先端の約25〜30 mmを残して折り返します。
- 春のアクションを提供する2つの突起の間に任意の適切なプラスチックスペーサー（ボタンなど）と一緒に修正された鉗子を元に戻します。
- 電気機器：我々は、エレクトロポレーションし、配信されるパルスの波形と数を確認するためにオシロスコープおよびオーディオモニターのための電流パルスを供給する電気刺激装置を使用する。
- また、刺激装置と直列に接続されているフットペダルに鉗子の一芯からワイヤを接続します。フットペダルはスイッチとして機能します。それは、エレクトロポレーション用の回路を完了すると落ち込んで。
- 他の突起からの電気刺激装置にワイヤを接続します。
- オシロスコープおよびオーディオモニターに刺激を接続します。
- マイクロピペットおよびインジェクタは、セットアップ ：私たちは、直接網膜に色素またはDNA溶液の非常に少量を注入するために鋭いプルガラスピペットとNanoinject IIインジェクターシステムを使用してください。
- 3軸マニピュレータ上にマウントインジェクターシステム。
- 長いテーパーと小さな先端のガラスピペットを引き出します。
- バック鉱物油とインジェクタへのセキュリティで保護された（詳細についてはNanoinect II取扱説明書を参照）で引っ張らピペットを埋める。
- 鋭いmicrodissectingはさみを使って小さな開口部（〜2-3μm）を作成し、ピペットの先端をカット。
- ピペットの先端を介して注射液を所望の量でピペットを埋める。先端の整合性が保持している限りとして、それは複数の注射や動物に使用することができます。
注：私は）十分な注射液が充填鉱物油が目に注入されることのないようなヒントにロードされていることを確認します。 ⅱ）Nanoinject IIシステムとこのビデオで使用される特定の電子機器はRGCsの成功したラベルを得るために重要ではありません。そのような他の一般的な刺激とpicospritzerやエレクトロなどの他のデバイスで作られた注射は、ラベルのRGCsにも使用できます。
2。 RGC標識用プラスミドソリューション
- RGCsの小さなクラスターを標識するため ：私たちは、CAGプロモーター（CMV即時初期エンハンサーとニワトリβ-アクチンプロモーター）の制御下に構造エンコーディングEGFPを（2〜3μg/μLの）強化された緑色蛍光タンパク質）を使用します。 EGFPは細胞膜（mut4EGFP）12にそれを標的とGAP - 43（成長関連タンパク質- 43）のパルミトイル化シーケンスでタグ付けされます。このコンストラクトはpCAG - gapEGFPと呼ばれます。
- 単一の細胞標識のために：我々は2つの構成要素の組み合わせを使用してください。最初のベクトルは、Creリコンビナーゼを駆動するCAGプロモーター（pCAG - Creを、Addgene [ケンブリッジ、MA]プラスミド13775）13であり、第二のベクターはEGFP（pCAG - LNL - gapEGFP）を標的膜に続くfloxed STOPカセットが含まれています。 pCAG - CRE（〜0.15-ng/μLが）のおかげで、少数の細胞（に強いEGFPの発現を閉じ込め、pCAG - LNL - gapEGFP（1〜2μgμL）より約1,000-10,000倍低い濃度で使用されています比較的低pCAG - Creを濃度）。
3。網膜インジェクション、エレクトロポレーションプロトコル
- P5よりも古いマウスは、ケタミンのカクテルの腹腔内注射（0.7 ml / kgを）（4.28 mg / mLの）で麻酔しながらP5の仔に出生後0日目は（P0）、低体温症によって麻酔し、キシラジン（0.82 mg / ml）を、およびアセプロマジン（0.07mg/ml）14。
- ホットビーズ滅菌器内のすべての手術器具と電極チップを滅菌する。眼への熱損傷を避けるために、使用前に滅菌生理食塩水の両方で、その後涼しい。
- 解剖の範囲と位置インジェクタ下の場所のマウス。
- P14（アイ開口前）よりも若いマウスの場合、外科的にミクロ解剖春のはさみb を持つ将来の眼瞼開裂の全長に沿ってカットすることでまぶたを開く。
- 眼球が部分的に優しく鉗子Cの先端で目の周りに圧力を加えて突出してください。
- 優しく眼球の周りの皮膚をつまんで場所に目を保持する。
- マイクロマニピュレータを調整し、眼球の近くにピペットをもたらす。
- 注射液の数滴を追放し、従ってピペットの目詰まりがないことを確認するために、Nanoinject IIシステムに接続されているフットペダルを、押します。
- 眼球を安定させる一方で、ガラスピペットの先端が網膜色素上皮を介して貫通し、網膜に入るようマニピュレータを移動する。
- DESを注入するNanoinject IIシステム用のフットペダルを押すことにより、溶液の量を赤外LED。例えば、単一のRGCsにラベルを付ける私達は2.3 4.6nLの単回注射を行う。
- ピペットを収納し、慎重に注射部位を介して直接電極チップを配置し、回路を完成し、目をエレクトロに刺激するためのフットペダルを押し下げる。我々は一般的に25V強、50ミリ秒持続時間、間隔1秒の設定で矩形パルスを使用してください。 10パルス（各極性の5パルス）P4と6パルスより古いマウス（各極性の3パルス）に適用されていますがP0にP3マウスに適用されます。
- 慎重にソケットに戻す眼球を押して、カットのまぶたを介して滅菌眼軟膏を適用する。
- 温度制御された熱パッドで、十分な復温と機動性を含めて完全な復旧、の上に置いて動物は、母親に動物を返します。
- 動物のような運動機能の喪失、新郎の姿勢異常や障害など、痛み、苦痛や不快感、任意の符号のための12時間ごとに監視します。麻酔、注射とエレクトロポレーションの繰り返しのラウンドは、同じ動物で実行されるべきではない。
4。ノート
- このビデオで説明されている注射の方法は、"ブラインド"の注射です。アルビノマウスと着色されたソリューション（高速青の微量とDIIまたはプラスミド溶液）で作業する際に、これは注射の量や場所を可視化することが可能です。しかし、色素性マウスと系統の注入場所は、直接可視化することはできず、それゆえに口頭で、意図された網膜の場所やどのように遠くまでは特にRGC層をターゲットにピペットを移動する必要があるに達しているかどうかを記述することは困難です。したがって、我々は強くこれらの注射は、網膜ですぐに視覚化できるため、最初のアルビノマウスのDIIの注射で開始する新規ユーザーに助言し、RGC網膜に投影し、脳のラベリングは、注入の品質を評価するために使用することができます。フォーカル注射のためのN、N -ジメチルホルムアミド（100％）で10％のDIIを準備します。この手順を習得されるとユーザーは、一貫して着色したマウスでは明らかなDNAプラスミドソリューションでRGCsをターゲットにすることができるはずです。
- このビデオで説明されている注射の方法は、retinotopy勉強する細胞のラベル小さな集団（4.6nLラベル数百RGCS）14とに結合した蛍光色素（Alexa555、488など）とバルクラベルのRGCsに焦点DIIの注射をするために使用することができますコレラ毒素サブユニットBは、上記の＃10のエレクトロポレーションのステップを除く、眼特異分離を検討する。すべてのソリューションのP14より若いマウスのためのP14と1 - 2uLより古いマウスの2 - 3uLの最大総注入量が推奨されます。
- ピペットは、インジェクタにピペットを装着する前にミネラルオイルで埋め戻し、チップを破壊することによって続いて注入するソリューションを充填することができます。ピペットの先端からロードすることは非常に粘性と困難な一般的な高濃度のDNA溶液を（〜6ug/uL）、使用するときに特に便利です。
- ガラスピペットの目詰まりになった場合、慎重に染料（DII）ソリューションのためのDNA溶液とエタノール（100％）のために水に浸した綿棒でピペットの先端を拭きます。
- 目に注入した後、眼球からピペットチップを収納して、再度注入するフットペダルを押してください。これは、先端が注入プロセスの間に詰まるされていないことを確認することです。解が分注されていない場合、それは注入が成功しない可能性が非常に高いです。しかし、これは注射が失敗したことを絶対的な記号として解釈されるべきではない。複数の注射部位や細胞の大規模な数のラベルが望まれる場合実験者は再び同じ目を注入することができる。
- シングルRGCsを標識するため、Nanoinjectのコントロールボックスで減速する射出速度を設定します。これにより、さらにシステムが同時にガラスピペットの先端が眼球からすぐに撤回されている間に解決策を分配するために、この設定でより多くの時間がかかるように網膜に注入された溶液の量を減らします。
- それは（これは目が通常よりも明らかに小さい場合に、回復の数日後に明らかになる）目を損傷することは非常に容易であるため、生後0〜3（P3 P0に）マウスのエレクトロポレーションは、さらに注意が必要です。印加されるパルスおよび電圧の数を減らすと、早期新生児マウスのお勧めです。 P4の後に、眼球はエレクトロポレーションによる損傷に対してより弾力性があります。
- EGFPまたはRFPの経験膜をターゲットバージョンでは（'gapEGFP'は、12を参照）、脳にretinofugal予測を調べるための未修正のGFPよりはるかに優れています。しかし、変更をターゲットと膜を欠いているpCAG - tdTomatoは、、また、うまく機能（図1E）。さらに、デキストランコンジュゲートの蛍光色素は、上述のエレクトロポレーションプロトコルを使用してラベルのRGCsするために使用することができます。
- 一般に、10注射のうち9はデュアルプラスミドアプローチで、ラベル付けRGCsに注射のものみの約15％を鉛化されなくなります。レッテルを貼られるだけで、単一のRGCになります。成功事例の数は、1つ目の複数の場所にDNAを注入することにより、またはそれぞれの目に異なる蛍光タンパク質をコードするプラスミドを注入することにより増加することができます。
5。代表的な結果
RGC標識は、エレクトロポレーションとトランスフェクション後少なくとも3週間の維持発現後24時間でRGCsにおけるEGFPのラベルで、P2からP25まで、あらゆる年齢層で観察された。
蛍光標識された樹状突起（図1A、B）と、単一のRGCsの軸索の喬木（図1F）が明確に可視化し、再構成することができる。
離れてRGCsから、この手法は、水平細胞、双極細胞と様々なアマクリン細胞のサブタイプ（図1C）などの他の網膜細胞の種類にラベルを付けるために使用することができます
SCの通常のretinotopy（図1E）が示すように、この方法では、視覚的なマップの洗練の通常の時間経過を妨げることはありません。
すべての年齢層では、ケースの約90％、pCAG - gapEGFPの小容量注入（〜2.3 - 4.6nLは）いくつかのRGCs（図1D）での発現につながった。
RGCs（図1A、B、D）やアマクリンのような他の細胞型を含む単一の網膜神経細胞のラベリングにつながったpCAG - CREおよび動物ごとpCAG - LNL - gapEGFP組み合わせのプラスミドの単回注射を使用して、試験の約15％で細胞（図1C）。
図1 - 。P8でシングルスターバーストアマクリン細胞の、B.出生後14日目のフラットマウントの網膜では、単一の網膜神経節細胞（矢印の頭が軸索を指す）というラベルのEGFPの例（P14）】実施例D。 。P14でフラットマウント網膜にRGCsとアマクリン細胞を含む網膜神経細胞を標識したEGFPのクラスタ。右目のE.背と腹側RGCsがエレクトロと左眼でEGFPと時間と腹RGCsで標識されたが電気めっきされたとP1でtdTomatoで標識。ラベル付けRGCsによって形成されるターゲットゾーン（アスタリスク）はP9のSCで、その地形的に正しい場所（ホールマウント、白の輪郭）で見ることができるのRGCアーバ（2次元投影）とラベルの付いた単一のEGFPの。F.例 SCの矢状断面（250μm厚）（点線）。明確にするために、画像の（D）及び（F）グレースケールに変換し、反転されています。スケールバー（ミクロン）：（） - （D）、（F）：100;（E）：500
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Discussion
このビデオでは、in vivoでのエレクトロポレーションプロトコルで示している蛍光タンパク質をコードするDNA構築物と出生後のマウスの網膜神経細胞の単一または小さなクラスターのラベリング結果。以前の研究では、そのエレクトロポレーションは、通常のRGC軸索アーバ洗練と干渉していないことを示す、親油性染料とRGCラベルを使用しているものとしてdLGNとSCに蛍光標識したRGCの突起の小さなクラスタでは、同様の投影パターンを再現。我々は正常と中断ビジュアルマップで様々なマウスモデルにおける単一およびRGCsのグループの両方のレベルでの網膜部位のマップを分析するためにこのプロトコルを利用してきた。
我々の結果は、出生後の網膜における差別化された網膜神経細胞を確実に生体内エレクトロポレーションに使用してトランスフェクトすることができることを示している。 生体エレクトロポレーションプロトコルの出生後には、空間的かつ時間的に制限された方法で同時ラベリングとRGCsの遺伝子操作を可能にするここで説明する。我々は、プラスミドエンコーディングCreリコンビナーゼとfloxed STOPのシーケンスで始まる蛍光レポーターの組み合わせを使用して、網膜神経細胞の標識を示しています。一貫性のある単一のニューロンのトランスフェクションは、レポータープラスミドからの相対非常に低いのCreプラスミド濃度を用いることにより達成される。 子宮内エレクトロポレーションでの比較では、この方法は低侵襲であり、視交叉でのクロスオーバーなどの初期の軸索ガイダンスのイベントを妨害することはありません。さらに、ウイルスのアプローチの相対、それは強力な遺伝子発現のための少ない時間を必要とし、毒性が少ないです。このツールは、両方misexpressionを通じて、総構造とシナプスレベルでまたは候補遺伝子のノックダウンretinofugal突 起の洗練と成熟を 媒介する細胞および分子メカニズムを調べるための効率的かつ迅速な手段を提供します。 生体ターゲティングRGCs で蛍光標識したもRGC軸索のダイナミクスとその生理学的特性の in vivo における二光子イメージングに使用することができます。要約すると、遺伝的に生体内で RGCsを対象とし、視覚化する能力は、出生後のマウスの視覚システムにおける回路の開発を支配する細胞および分子メカニズムの解明、さらに役立ちます。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
pCAG - gapEGFPプラスミド博士S. McConnellさん（スタンフォード、カリフォルニア州）から寄贈されたもの。 pCAG - tdTomatoプラスミド博士M.フェラー（バークレー、カリフォルニア州）から寄贈されたもの。我々は、技術サポートのためのパイロットスタディとCrairラボのメンバーの2つのプラスミドのCre / loxP部位戦略を検証するための単一細胞標識とアンSchohl（モントリオール、QC）の2つのプラスミドの戦略の使用を提案して博士エドワードRuthazerに感謝。 R01 MH62639（MC）、NIH R01 EY015788（MC）とNIH P30 EY000785（MC）によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Electrical Stimulator | Grass Technologies | Model S4 | |
| Oscilloscope | Agilent Technologies | Model 54621A | |
| Audio monitor | Grass Technologies | Model AM8B | |
| Puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | |
| Vannas Scissors a | World Precision Instruments, Inc. | 14003 | |
| Micro Scissors b | Ted Pella, Inc. | 1347 | |
| Dumont AA Forceps c | Fine Science Tools | 11210-20 | |
| Nanoinject II System | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Glass Pipettes | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Foot pedal | Drummond Scientific | 3-000-026 | |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M3516 | |
| DiI | Invitrogen | D-383 | |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | D4551 |
References
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