Summary
Demonstreren we een
Abstract
De doelgerichtheid en verfijning van RGC projecties naar de middenhersenen is een populaire en krachtige modelsysteem voor het bestuderen van hoe nauwkeurig patronen van neurale verbindingen vormen tijdens de ontwikkeling. Bij muizen zijn retinofugal projecties gerangschikt in een topografische wijze en vorm eye-specifieke lagen in de laterale geniculate Nucleus (dLGN) van de thalamus en de Superior colliculus (SC). De ontwikkeling van deze precieze patronen van retinofugal projecties heeft meestal onderzocht door middel van etikettering populaties van RGC met fluorescerende kleurstoffen en tracers, zoals mierikswortelperoxidase 1-4. Maar deze methoden zijn te grof om inzicht te krijgen in de ontwikkeling veranderingen in de individuele RGC axonale prieel morfologie, die de basis van retinotopische kaart formatie. Ze hebben ook niet mogelijk voor de genetische manipulatie van RGC.
Onlangs is elektroporatie uitgegroeid tot een effectieve methode voor het verstrekken van nauwkeurige ruimtelijke en temporele controle voor de levering van geladen moleculen in het netvlies 5-11. Huidige netvlies elektroporatie protocollen niet mogelijk voor genetische manipulatie en het traceren van retinofugal projecties van een enkele of een kleine cluster van RGC in postnatale muizen. Er is betoogd dat postnatale in vivo elektroporatie niet is een levensvatbare methode voor transfecteren RGC, omdat de etikettering rendement is extreem laag en eist daarom dat gericht op embryonale leeftijd bij RGC voorouders zijn differentiatie en proliferatie 6 ondergaan.
In deze video beschrijven we een in vivo electroporatie protocol voor gerichte toediening van genen, shRNA, en fluorescerende dextranen voor muriene RGC postnataal. Deze techniek biedt een rendabele, snelle en relatief makkelijk platform voor een efficiënte screening van kandidaat-genen die betrokken zijn bij verschillende aspecten van neurale ontwikkeling, met inbegrip axon retractie, vertakking, lamineren, regeneratie en synapsvorming in verschillende stadia van ontwikkeling circuit. In het kort beschrijven we hier een waardevol hulpmiddel die verder inzicht verschaft in de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen zintuiglijke kaart ontwikkeling.
Protocol
1. Apparatuur Set-up voor Elektroporatie
- Elektroden: We gewijzigd Dumont # 5 tang te gebruiken als elektroden.
- Scheiden en splitsen de tang.
- Soldeer een draad aan het bredere eind van elk uitsteeksel. Wikkel de draad aangesloten en tanden met isolatietape het verlaten van ongeveer 25-30 mm van de tip van de blootgestelde de tanden.
- Leg de gewijzigde pincet terug, samen met een geschikte plastic spacer (bijvoorbeeld een knop) tussen de twee tanden aan veerwerking te bieden.
- Elektrische uitrusting: We maken gebruik van een elektrische stimulator de huidige pulsen te leveren voor elektroporatie en een oscilloscoop en audio-monitor op de golfvorm en het aantal pulsen worden afgeleverd te bevestigen.
- Sluit de draad van een uitsteeksel van de tang om een voetpedaal, die ook verbonden is in serie met de stimulator. Het voetpedaal werkt als een schakelaar. Als depressief is voltooid het circuit voor de elektroporatie.
- Sluit de kabel van de andere uitsteeksel aan de elektrische stimulator.
- Sluit de stimulator van de oscilloscoop en audio monitor.
- Micropipet en injector set-up: We maken gebruik van scherpe trokken glazen pipetten en de Nanoinject II injector systeem om zeer kleine hoeveelheden kleurstof of DNA-oplossing direct in het netvlies te injecteren.
- Mount injector systeem op een 3-assige micromanipulator.
- Trek glazen pipetten met een lange kaars en kleine tip.
- Terug vul de getrokken pipet met minerale olie en veilig om injector (voor details Nanoinect II handleiding te zien).
- Met behulp van scherpe microdissecting schaar een knip het uiteinde van de pipet, het creëren van een kleine opening (~ 2-3 um).
- Vul de pipet met de gewenste hoeveelheid van de injectie-oplossing door middel van de punt van de pipet. Zolang de integriteit van de tip houdt, kan het worden gebruikt voor meerdere injecties en dieren.
Let op: i) Zorg voor voldoende oplossing voor injectie is geladen in de tips zodanig dat opgevuld minerale olie nooit wordt geïnjecteerd in het oog. ii) De Nanoinject II-systeem en de specifieke elektronische apparatuur die in deze video niet kritisch zijn voor het bereiken van een succesvolle etikettering van de RGC. Injecties gemaakt met andere apparaten, zoals een picospritzer en elektroporatie met andere gemeenschappelijke stimulatoren kan ook worden gebruikt om het etiket RGC.
2. Plasmide Oplossingen voor RGC Labeling
- Voor de etikettering kleine clusters van RGC: We maken gebruik van een construct dat codeert voor EGFP (~ 2-3 ng / ul) verhoogde green fluorescent protein) onder de controle van een CAG promoter (kip β-actine-promotor met een CMV immediate early versterker). EGFP wordt getagd met de palmitoylatie volgorde van de GAP-43 (groei associated protein-43) gericht op het aan het celmembraan (mut4EGFP) 12. Deze constructie wordt aangeduid als pCAG-gapEGFP.
- Voor enkele cel etikettering: We gebruiken een combinatie van twee constructen. De eerste vector is een CAG promotor rijden Cre recombinase (pCAG-Cre, Addgene [Cambridge, MA] plasmide 13.775) 13 en de tweede vector bevat een floxed STOP cassette gevolgd door een membraan gerichte EGFP (pCAG-LNL-gapEGFP). pCAG-Cre (~ 0.15-ng/μL) wordt gebruikt op ongeveer 1.000-10.000-maal lagere concentratie dan pCAG-LNL-gapEGFP (~ 1-2 μgμL), beperken sterke EGFP expressie om een klein aantal cellen (op grond van de relatief lage pCAG-Cre concentratie).
3. Retinal Injectie en elektroporatie Protocol
- Postnatale dag 0 (P0) tot P5 pups worden verdoofd door onderkoeling, terwijl de muizen ouder dan P5 worden verdoofd met een intraperitoneale injectie (0,7 ml / kg) van een cocktail van ketamine (4,28 mg / ml), xylazine (0,82 mg / ml) , en acepromazine (0.07mg/ml) 14.
- Steriliseer alle chirurgische instrumenten en elektrode tips in een hete kraal sterilisator. Vervolgens koel zowel in steriele zoutoplossing voorafgaand aan het gebruik van thermische schade aan het oog te voorkomen.
- Plaats de muis onder een dissectie omvang en positie injector.
- Voor muizen jonger dan P14 (vóór opening van de ogen), chirurgisch openen van de oogleden door te snijden langs de gehele lengte van de toekomstige ooglid opening met micro ontleden van de lente schaar b.
- Maak de oogbol gedeeltelijk uitsteken door voorzichtig druk uit te oefenen rond de ogen met de toppen van de tang c.
- Houd het oog in plaats van zacht knijpen de huid rond de oogbol.
- Pas micromanipulator en breng pipet de buurt van de oogbol.
- Druk op voetpedaal, die is aangesloten op het Nanoinject II-systeem, een paar druppels van de injectie-oplossing te verdrijven en dus dat de pipet niet verstopt is te controleren.
- Met de ene hand het stabiliseren van de oogbol, beweegt u de micromanipulator zodanig dat het uiteinde van de glazen pipet doorboort door de retinale pigment epitheel en komt het netvlies.
- Injecteren desIRED hoeveelheid van de oplossing door te drukken op de voet pedaal voor de Nanoinject II-systeem. Bijvoorbeeld, om een RGC maken we een enkele injectie van 2,3-4.6nL label.
- Trek de pipet en zorgvuldig direct plaats elektrode tips op de injectieplaats en druk voetpedaal voor stimulator om het circuit te voltooien en het oog electroporate. Wij gebruiken meestal de vierkante pulsen met de instellingen van de 25V kracht, 50msec duur, 1sec uit elkaar. 10 pulsen (5 pulsen van elke polariteit) worden toegepast voor muizen ouder dan P4 en 6 pulsen (3 pulsen van elke polariteit) zijn voor P0 toegepast op P3 muizen.
- Voorzichtig terug te duwen in de oogbol stopcontact en toe te passen steriele oogzalf over de afgeknipte oogleden.
- Plaats dieren op een temperatuur gecontroleerde warmte-pad en op volledig herstel, met inbegrip van voldoende opwarmen en mobiliteit, terugkeer dier naar hun moeder.
- Monitor dieren elke 12 uur op tekenen van pijn, angst of ongemak, zoals het verlies van mobiliteit, abnormale houding of het niet te verzorgen. Herhaalde rondes van anesthesie, injecties en elektroporatie mag niet worden uitgevoerd op hetzelfde dier.
4. Opmerkingen
- De methode van injectie zoals beschreven in deze video is een 'blind' injectie. Het is mogelijk om de hoeveelheid en de locatie van de injectie te visualiseren bij het werken met albino muizen en gekleurde oplossingen (DII of plasmide oplossing met sporen van snelle blauw). Echter, met gepigmenteerde muizen stammen de injectie locatie kan niet worden direct gevisualiseerd en dus is het moeilijk om verbaal beschrijven of heeft men de beoogde locatie netvlies bereikt of hoe ver men moet de pipet naar het RGC laag specifiek doel. Daarom adviseren wij nieuwe gebruikers om te beginnen met Dii injecties in albino muizen, omdat deze injecties kan worden direct gevisualiseerd in het netvlies en de etikettering van RGC projecties aan het netvlies en de hersenen kan worden gebruikt om de kwaliteit van de injectie te beoordelen. Bereid 10% DII in N, N-dimethylformamide (100%) voor focale injecties. Zodra deze procedure is de knie-gebruikers moeten in staat zijn om consistent RGC doelgroep met een duidelijke DNA-plasmide-oplossingen in gepigmenteerde muizen.
- De methode van injectie zoals beschreven in deze video kan worden gebruikt om focale DII injecties aan te brengen in kleine populaties van cellen om retinotopy (4.6nL labels een paar honderd RGC) 14 te bestuderen en om bulk label RGC met fluoroforen (Alexa555, 488 etc.) geconjugeerd aan label choleratoxine subunit B tot oog-specifieke segregatie studie, met uitzondering van de elektroporatie stap in # 10. Een maximale totaal injectievolume van 2-3uL voor muizen ouder dan P14 en 1-2uL voor muizen die jonger zijn dan P14 van elke oplossing is aan te bevelen.
- Pipetten kan worden opgevuld met oplossingen te geïnjecteerd worden gevolgd door opvullen met minerale olie voor het monteren van de pipet op de injector en het breken van de tip. Dit is vooral handig bij het gebruik van een hoge concentratie DNA-oplossingen (~ 6ug/uL), die het algemeen zeer viskeus en moeilijk te laden van de punt van de pipet.
- Als de glazen pipet verstopt raakt, zorgvuldig veeg de pipetpunt met een wattenstaafje gedrenkt in water voor DNA-oplossingen en ethanol (100%) voor de kleurstof (DII) oplossingen.
- Na de injectie in het oog, trekken de pipet tip van de oogbol en druk op het voetpedaal om opnieuw te injecteren. Dit is om te bevestigen dat de tip niet verstopt raken tijdens de injectie proces. Als er geen oplossing is afgegeven, is het zeer waarschijnlijk dat de injectie niet succesvol was. Dit moet echter niet worden beschouwd als een absolute teken dat de injectie niet succesvol was. De experimentator kan injecteren dezelfde ogen weer als er meerdere injectieplaatsen en de etikettering van groter aantal cellen is gewenst.
- Voor het labelen van een RGC, stelt u de injectie snelheid te remmen op de Nanoinject schakelkast. Deze verdere vermindert de hoeveelheid van de oplossing geïnjecteerd in het netvlies als het systeem neemt meer tijd in deze instelling af te zien van de oplossing, terwijl tegelijkertijd het uiteinde van de glazen pipetten wordt snel teruggetrokken uit de oogbol.
- Elektroporatie van postnatale dag 0 tot 3 (P0 tot P3) muizen vereist extra zorg omdat het heel gemakkelijk om de ogen schade (dit wordt duidelijk na een paar dagen van herstel, wanneer het oog is aantoonbaar kleiner dan normaal). Vermindering van het aantal pulsen en spanning is aan te raden voor de vroege neonatale muizen. Na de P4, de oogbollen zijn beter bestand tegen schade door de elektroporatie.
- In onze ervaring membraan gerichte versies van EGFP of RFP ("gapEGFP ', zie 12) zijn veruit superieur aan ongewijzigde GFP voor het onderzoek van retinofugal projecties naar de hersenen. Echter, pCAG-tdTomato, wat een membraan gericht op wijziging ontbreekt, werkt ook goed (figuur 1E). Daarnaast kunnen dextran geconjugeerd fluorescerende kleurstoffen ook gebruikt worden om het etiket RGC met behulp van de elektroporatie protocol zoals hierboven beschreven.
- Typisch, zal 9 van de 10 injecties leiden tot het label RGC, hoewel slechts ongeveer 15% van injecties met de dubbele plasmide aanpakresulteren in slechts een enkele RGC het etiket. Het aantal succesvolle gevallen kan worden verhoogd door het injecteren van DNA op meerdere locaties in een oog of door het injecteren van plasmiden die coderen voor verschillende fluorescerende eiwitten in elk oog.
5. Representatieve resultaten
RGC labeling werd waargenomen bij alle leeftijden, variërend van P2 tot P25, met EGFP etikettering in het RGC van 24 uur na elektroporatie en onderhouden uitdrukking voor ten minste drie weken na transfectie.
Fluorescent gelabelde dendrieten (Figuur 1A, B) en axonale priëlen (Figuur 1F) van enkelvoudige RGC kunnen worden duidelijk gevisualiseerd en gereconstrueerd.
Naast de RGC, kan deze techniek worden gebruikt om andere retinale celtypes, zoals horizontale cellen, bipolaire cellen en diverse amacrine cel subtypes (Figuur 1C) label
Deze methode is niet interfereren met de normale tijdsverloop van visuele kaart verfijning, zoals aangetoond door de normale retinotopy in de SC (figuur 1E).
Op alle leeftijden, in ongeveer 90% van de gevallen, een klein volume injectie (~ 2.3-4.6nL) van pCAG-gapEGFP leidde tot uitdrukking in een paar RGC (figuur 1D).
In ongeveer 15% van de proeven met een enkele injectie van de pCAG-Cre en pCAG-LNL-gapEGFP combinatie plasmiden per dier, heeft geleid tot enkele netvlies neuron etikettering inclusief RGC (Figuur 1A, B, D) en andere soorten cellen, zoals amacrine cellen (Figuur 1C).
Figuur 1 - A, B. Voorbeelden van EGFP enkel retinale ganglioncellen (pijlpunt wijst naar axon) gemerkt in een flat-mount netvlies aan postnatale dag 14 (P14) C. Voorbeeld van enkele starburst amacrine cel op P8 D.. . Een cluster van EGFP gelabeld het netvlies neuronen waaronder RGC en amacrine cellen in een flat-mount netvlies aan P14. E. Dorsale en ventrale RGC in het rechter oog waren geëlektroporeerd en voorzien van EGFP en temporele en ventrale RGC in het linker oog werden gegalvaniseerd en gelabeld met tdTomato op P1. De beoogde zones (sterretjes), gevormd door de gelabelde RGC is te zien in hun topografisch juiste plaats in de SC op P9 (whole-mount, witte outline). F. Voorbeeld van een enkel EGFP gelabeld RGC prieel (2-D projectie) in een sagittale doorsnede (250 micrometer dik) van de SC (stippellijn). Voor de duidelijkheid, afbeeldingen in (D) en (F) zijn omgezet in grijswaarden en ondersteboven. Schaal bars (um): (A) - (D), (F): 100; (E): 500
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze video zien we een in vivo electroporatie protocol dat resulteert in de etikettering van enkele of kleine clusters van retinale neuronen in postnatale muizen met DNA-constructen die coderen voor fluorescerende eiwitten. Kleine clusters van fluorescent gelabelde RGC projecties naar de dLGN en SC gereproduceerd soortgelijke projectie patronen als eerdere studies met behulp van RGC etikettering met lipofiele kleurstoffen, wat aangeeft dat elektroporatie niet interfereren met de normale RGC axon prieel verfijning. We hebben gebruikt dit protocol om de retinotopische kaart te analyseren op het niveau van zowel single en groepen van RGC in verschillende muismodellen met een normale en verstoorde visuele kaarten.
Onze resultaten tonen aan dat gedifferentieerde retinale neuronen in de postnatale netvlies betrouwbare wijze kan worden getransfecteerd met behulp van in vivo elektroporatie. De postnatale in vivo elektroporatie beschreven protocol hier zorgt voor simultaan etikettering en genetische manipulatie van RGC in een ruimtelijk en temporeel beperkte wijze. Tonen we de etikettering van het netvlies neuronen met behulp van een combinatie van plasmiden die coderen voor Cre recombinase en tl-verslaggever voorafgegaan door floxed STOP volgorde. Consistente enkel neuron transfectie wordt bereikt door met behulp van extreem lage Cre-plasmide-concentratie ten opzichte van de reporter plasmide. In vergelijking met in utero elektroporatie, deze methode is minder invasief en interfereert niet met de vroege axon begeleiding evenementen, zoals de oversteek bij de optisch chiasma. Daarnaast is ten opzichte van virale aanpak, vereist het minder tijd voor sterke genexpressie en is minder toxisch. Deze tool biedt een efficiënte en snelle wijze voor de behandeling van de cellulaire en moleculaire mechanismen bemiddelen de verfijning en de rijping van retinofugal projecties zowel op de bruto-structurele en synaptische niveau via de misexpression of knock down van kandidaat-genen. In vivo targeting RGC met een fluorescent label ook kan worden gebruikt voor in vivo twee-foton beeldvorming van RGC axon dynamiek en hun fysiologische eigenschappen. Kortom, de mogelijkheid om genetisch richten en te visualiseren RGC in vivo postnataal verder zal helpen verhelderen van de cellulaire en moleculaire mechanismen die circuit ontwikkeling in de muis visuele systeem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De pCAG-gapEGFP plasmide was een geschenk van dr. S. McConnell (Stanford, CA). pCAG-tdTomato plasmide was een geschenk van dr. M. Feller (Berkeley, CA). Wij danken dr. Edward Ruthazer voor het suggereren het gebruik van een twee-plasmide strategie voor enkele cel etikettering en Anne Schohl (Montreal, QC) voor de validatie van de twee-plasmide Cre / loxP strategie in pilot-studies en Crair lab leden voor technische ondersteuning. Ondersteund door R01 MH62639 (MC), NIH R01 EY015788 (MC) en NIH P30 EY000785 (MC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Electrical Stimulator | Grass Technologies | Model S4 | |
| Oscilloscope | Agilent Technologies | Model 54621A | |
| Audio monitor | Grass Technologies | Model AM8B | |
| Puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | |
| Vannas Scissors a | World Precision Instruments, Inc. | 14003 | |
| Micro Scissors b | Ted Pella, Inc. | 1347 | |
| Dumont AA Forceps c | Fine Science Tools | 11210-20 | |
| Nanoinject II System | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Glass Pipettes | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Foot pedal | Drummond Scientific | 3-000-026 | |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M3516 | |
| DiI | Invitrogen | D-383 | |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | D4551 |
References
- Huberman, A. D., Feller, M. B., Chapman, B. Mechanisms underlying development of visual maps and receptive fields. Annu Rev Neurosci. 31, 479-509 (2008).
- McLaughlin, T., Torborg, C. L., Feller, M. B., O'Leary, D. D. Retinotopic map refinement requires spontaneous retinal waves during a brief critical period of development. Neuron. 40, 1147-1160 (2003).
- Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. Prenatal and postnatal development of retinogeniculate and retinocollicular projections in the mouse. J Comp Neurol. 230, 552-575 (1984).
- Jaubert-Miazza, L. Structural and functional composition of the developing retinogeniculate pathway in the mouse. Vis Neurosci. 22, 661-676 (2005).
- Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation. BMC Dev Biol. 7, 103-103 (2007).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Analysis of gene function in the retina. Methods Mol Biol. 423, 259-278 (2008).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. J Vis Exp. , (2009).
- Ishikawa, H. Effect of GDNF gene transfer into axotomized retinal ganglion cells using in vivo electroporation with a contact lens-type electrode. Gene Ther. 12, 289-298 (2005).
- Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J Vis Exp. , (2008).
- Ruthazer, E. S., Haas, K., Javaherian, A., Jensen, K., Sin, W. C., Cline, H. T. In vivo time- lapse imaging of neuronal development. Imaging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual. Yuste, R., Konnerth, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 191-204 Forthcoming.
- Kachi, S., Oshima, Y., Esumi, N., Kachi, M., Rogers, B., Zack, D. J., Campochiaro, P. A. Nonviral ocular gene transfer. Gene Ther. 12, 843-851 (2005).
- Okada, A., Lansford, R., Weimann, J. M., Fraser, S. E., McConnell, S. K. Imaging cells in the developing nervous system with retrovirus expressing modified green fluorescent protein. Exp Neurol. 156, 394-406 (1999).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 1027-1032 (2007).
- Plas, D. T. morphogenetic proteins, eye patterning, and retinocollicular map formation in the mouse. J Neurosci. 28, 7057-7067 (2008).
