Summary
우리는를 보여
Abstract
midbrain에 RGC 예측의 대상 및 개선 개발하는 동안 신경 연결 양식의 방법은 정확한 패턴을 공부에 대한 인기있는 강력한 모델 시스템입니다. 생쥐에서 retinofugal 전망은 시상 및 우수 Colliculus (SC)의 래터럴 Geniculate 핵의 지형 방식과 양식 눈 특정 레이어 (dLGN)에 정렬됩니다. retinofugal 예측 이러한 정확한 패턴의 개발은 일반적으로 같은 양고추냉이 퍼옥시데이즈 1-4로 형광 염료와 추적기와 RGCs의 인구를 분류하여 연구되었습니다. 그러나 이러한 방법은 retinotopic지도 형성의 기초있는 개별 RGC axonal 아버 형태의 발달 변화에 대한 통찰력을 제공하기 위해 너무 거칠어. 또한 RGCs의 유전자 조작에 대한 허용하지 않습니다.
최근 electroporation은 망막 5-11로 청구 분자의 제공을위한 정확한 공간과 시간적 제어를 제공하는 효과적인 방법이되었다. 현재 망막 electroporation 프로토콜은 유전자 조작을 허용하고 출생 후의 생쥐에 RGCs의 단일 또는 작은 클러스터의 retinofugal 예측을 추적하지 않습니다. 그것은 생체내의 electroporation에 출생 후의이 상표 효율이 매우 낮은이기 때문에 RGCs를 transfecting위한 가능한 방법이 아니므로 그러므로 RGC progenitors가 분화 및 증식 6 겪고 아르 배아 연령 타겟팅에 필요하다는 주장했습니다.
이 비디오에서 우리는 타겟 유전자의 전달, shRNA, 및 postnatally murine RGCs에 형광 dextrans에 대한 생체내의 electroporation 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 기술은 분기, 라미네이션, 재생 및 회로 개발의 다양한 단계에서 버렸네 형성, 축삭의 철회를 포함한 신경 발달의 여러 측면에 관련된 후보 유전자의 효율적인 심사를위한 빠르고 효율적인 비용과 상대적으로 쉬운 플랫폼을 제공합니다. 요약 우리는 여기에 감각지도 개발을 기본 분자 메커니즘에 대한 통찰력을 제공할 것입니다 가치있는 도구를 설명합니다.
Protocol
1. 설정 Electroporation을위한 장비
- 전극 : 우리는 더몬트에게 전극으로 사용하기 # 5 포셉을 수정했습니다.
- 분리와 포셉을 따로 휴식.
- 각 단자의 넓은 끝에 솔더 와이어. 전선 연결 및 절연 테이프와 접지 단자가 노출 접지 단자의 끝에 약 25~30밀리미터 떠나을 바꿈.
- 스프링 동작을 제공하기 위해 두 접지 단자 사이에 적당한 플라스틱 스페이서 (예 : 단추)와 다시 함께 수정된 포셉 놔.
- 전기 장비 : 우리는 배달되는 펄스의 파형과 번호를 확인 electroporation과 오실로 스코프 및 오디오 모니터링에 대한 현재 펄스를 전달하기 위해 전기 자극기를 사용합니다.
- 또한 자극기와 직렬로 연결된 발을 페달에 포셉 중 한 단자에서 와이어를 연결합니다. 발 페달은 스위치 역할을합니다. 언제 우울 그것은 electroporation을 위해 회로를 완료합니다.
- 다른 접지 단자에서 전기 자극기에 와이어를 연결합니다.
- 오실로 스코프 및 오디오 모니터 자극기를 연결합니다.
- 설정 Micropipette 및 분사기 : 우리가 직접 망막에 염료 또는 DNA 솔루션의 아주 작은 볼륨을 삽입하는 날카로운 뽑아 유리 pipettes 및 Nanoinject II 연료 분사 시스템을 사용합니다.
- 3 축 micromanipulator에 마운트 인젝터 시스템.
- 긴 테이퍼 작은 팁과 유리 pipettes을 당기세요.
- 위로 (자세한 내용은 Nanoinect II 지침 설명서를 참조)을 광유 및 주입기 확보로 뽑아 피펫을 입력합니다.
- 날카로운 microdissecting 가위를 사용하여이 작은 오프닝 (~ 2-3 μm의)를 작성, 피펫의 끝을 잘라.
- 피펫의 팁을 통해 사출 솔루션의 원하는 금액으로 피펫을 입력합니다. 마찬가지로 긴 팁의 무결성이 유지로, 그것은 여러 주입과 동물에 사용할 수 있습니다.
참고 : I) 충분한 사출 솔루션 backfilled 미네랄 오일이 눈 안으로 주입되지 않습니다 그러한 조언에로드되어 있는지 확인. II) Nanoinject II 시스템과이 동영상에서 사용되는 특정 전자 장비는 RGCs의 성공 라벨 달성을위한 중요하지 않습니다. 같은 다른 일반적인 stimulators와 picospritzer과 electroporation과 같은 다른 장치로 만든 주사는 레이블 RGCs에도 사용할 수 있습니다.
2. RGC 라벨링에 대한 플라스미드 솔루션
- RGCs 작은 클러스터를 라벨의 경우 : 우리는 우리 편대의 편대 장 모터 (CMV 즉시 초기 확장기와 닭고기 β - 굴지 프로 모터)의 제어하에 구조 인코딩 EGFP를 (~ 2-3 μg / μL) 향상된 녹색 형광 단백질)을 사용합니다. EGFP는 세포막 (mut4EGFP) 12 그것을 대상으로 GAP - 43의 palmitoylation 순서 (성장 단백질 - 43 관련) 태그가 있습니다. 이 구조는 pCAG - gapEGFP이라고합니다.
- 단세포 라벨의 경우 : 두 가지 구성의 조합을 사용합니다. 첫 번째 벡터는 Cre 호텔 recombinase (pCAG - Cre 호텔, Addgene [캠브리지, MA] 플라스미드 13775) 13 번째 벡터 EGFP (pCAG - LNL - gapEGFP)를 타겟으로 막 다음 floxed STOP 카세트를 포함 운전 편대의 편대 장 발기인이다. pCAG - Cre 호텔은 (~ 0.15-ng/μL) (의 미덕에 의해 세포의 소수에 강한 EGFP 식을 confining, pCAG - LNL - gapEGFP (~ 1-2 μgμL)보다 약 1,000-10,000 배 낮은 농도에서 사용 상대적으로 낮은 pCAG - Cre 호텔의 농도).
3. 망막 사출 및 Electroporation 프로토콜
- P5 세 이상 쥐가 마취제 (4.28 MG / ML), xylazine (0.82 MG / ML)의 칵테일의 intraperitoneal 주사 (0.7 ML / kg)과 anesthetized하는 동안 출생 후의 일 P5의 새끼 0 (P0)는 저체온증으로 anesthetized 아르 하고, acepromazine (0.07mg/ml) 14.
- 뜨거운 비드 살균기의 모든 수술기구 및 전극 팁 소독. 눈에 열 손상을 방지하기 위해 사용하기 전에 멸균 생리에 모두 연속적으로 냉각.
- 절개 범위와 위치에 따라 인젝터 플레이스 마우스.
- P14 (눈 열기 전에)보다 어린 생쥐의 경우, 수술 해부 마이크로 스프링 가위 B와 함께 미래를 여는 눈꺼풀의 전체 길이에 따라 절단하여 눈꺼풀을 엽니다.
- 눈알 부분적으로 부드럽게 포셉 C의 도움말로 눈 주위에 압력을 적용하여 내다합니다.
- 부드럽게 안구 주변의 피부를 곤란하게하여 장소에 시선을 잡아.
- micromanipulator를 조정하고 안구에 가까운 피펫을 가지고.
- 사출 솔루션의 몇 방울을 추방하기 때문에 피펫이 막힌 아니라는 것을 확인 Nanoinject II 시스템에 연결되어 보도 풋 페달.
- 눈알을 안정화 한손으로, 유리 피펫의 끝은 망막 안료 상피를 통해 피어와 망막를 입력 이러한 micromanipulator 이동합니다.
- 데스을 주사Nanoinject II 시스템을위한 발 페달을 눌러 솔루션을 ired 금액입니다. 예를 들어, 우리는 2.3 - 4.6nL의 단일 주사를 단일 RGCs 레이블을합니다.
- 피펫을 접어야 조심스럽게 사출 현장에 직접 전극 팁을 배치하고 회로를 작성하여 눈을 electroporate에 자극기를위한 발 페달을 놓으면 되죠. 우리는 일반적으로 25V 강도, 50msec 기간, 간격 1sec의 설정을 사용하여 사각형 펄스를 사용합니다. 10 펄스 (각 극성의 5 펄스)이 P4보다 오래된 6 펄스 (각 극성 3 펄스)가 P3 마우스로 P0에 대해 적용되는 생쥐에 대해 적용됩니다.
- 부드럽게 소켓에 다시 눈알을 밀고 컷 눈꺼풀 이상 살균 안과 연고를 적용합니다.
- 온도 제어 열 패드 및 적절한 rewarming와 이동성을 포함하여 완벽한 복구에 플레이스 동물은 그들의 어머니 동물을 반환합니다.
- 동물에게 이러한 이동성의 손실, 신랑에 비정상적인 자세 또는 실패로 고통, 고통 또는 불편의 흔적을 위해 매 12 시간 모니터링합니다. 마취, 주사 및 electroporation의 반복 도는이 같은 동물에서 수행해서는 안됩니다.
4. 노트
- 이 동영상에서 설명하는 주입의 방법은 '맹인'주입니다. 그것은 흰둥이 마우스 및 색상 솔루션 (DiI 또는 빠른 푸른 미량의와 플라스미드 용액)로 작업할 때 주입의 양과 위치를 시각화 할 수 있습니다. 그러나, 색소 쥐 종자와 함께 사출 위치 직접 시각되지 않을 수 있으며, 따라서 그것은 구두로 한 의도 망막 위치를 도달하거나 얼마나 하나가 특별히 RGC 계층을 대상으로 피펫으로 이동할지 여부를 설명하기가 어렵습니다. 따라서, 우리는 강력하게 이러한 주사는 망막에 즉시 시각 될 수 있기 때문에 첫번째 흰둥이 마우스의 DiI 주사와 함께 시작하는 새 사용자를 조언하고 RGC 망막에 투영 및 두뇌의 상표는 사출의 품질을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 초점 주사에 대한 N에서 10 % DiI, N - Dimethylformamide (100 %)를 준비합니다. 일단이 절차가 마스터는 사용자가 지속적으로 색소 생쥐의 명확한 DNA 플라스미드 솔루션 RGCs를 타겟팅할 수 있어야합니다.
- 이 동영상에서 설명하는 주입의 방법은 retinotopy (4.6nL 라벨 몇 백 RGCS) 14을 공부하고 복합 fluorophores (Alexa555, 488 등)와 함께 대량 레이블 RGCs로하는 세포의 작은 인구를 라벨에 초점 DiI 주사를 만들기 위해 사용할 수 있습니다 콜레라 독소의 subunit B는 위의 10 electroporation 단계 제외한 눈 특정 분리를 연구하기 위해 서요. 모든 솔루션의 P14 미만 마우스에 대한 P14 1 - 2uL보다 나이가 생쥐를위한 2 - 3uL의 최대한의 총 주사 량을 권장합니다.
- Pipettes는 인젝터에 피펫을 장착하고 팁을을 깨고 전에 광유와 backfilling하여 주입을 따라하는 솔루션 backfilled 수 있습니다. 피펫의 팁을에서로드하는 것은 매우 점성하고 어려운 일반적으로 높은 농도의 DNA 솔루션 (~ 6ug/uL), 사용할 때 특히 유용합니다.
- 유리 피펫은 막힌되면, 염료 (DiI) 솔루션을위한 DNA 솔루션과 에탄올 (100 %) 물에 젖었을 면봉으로 피펫 팁을 조심스럽게 닦으십시오.
- 눈에 주입 후 안구의 피펫 팁을 철회하고 다시 삽입하기 위해 발 페달을 누르십시오. 이것은 팁는 사출 과정에서 막힌 못 있는지 확인하는 것입니다. 어떤 해결 방법이 적절하지 않으면, 그것은 분사가 성공적으로 완료되지 않은 것을 매우 가능성이 높습니다. 그러나, 이것은 주사가 성공적으로 완료되지 않은 것을 절대 기호로 이동해서는 안됩니다. 여러 분사 사이트와 세포의 큰 숫자 라벨이 원하는 경우 실험자 다시 같은 눈을 주입 수 있습니다.
- 단일 RGCs을 라벨 들어, Nanoinject 제어 상자에서 속도를 사출 속도를 설정합니다. 이것은 더 이상은 유리 pipettes의 동시 끝에이 안구에서 신속하게 철회하는 동안 시스템이 솔루션을 하는걸이 설정에 더 많은 시간을 소요로 망막에 주입 용액의 양을 줄여줍니다.
- 그것이 (이것은 복구의 몇 일 후에 확실한되고, 눈이 정상보다 명백히 작은 경우) 눈에 손상을 매우 쉽게되어 있기 때문에 출생 후의 오늘의 Electroporation 0으로 3 (P0 P3)을 마우스 추가 관리가 필요합니다. 적용 및 전압 펄스의 수를 줄이는 것은 조기 신생아 생쥐에 대한 것이 좋습니다. P4 후, 눈알은 electroporation 피해에 더 탄력있다.
- EGFP 또는 RFP 우리의 경험을 막 타겟 버전에서는 ( 'gapEGFP'가, 12 참조) 뇌로 retinofugal 계획을 조사를 위해 수정되지 않은 GFP보다 훨씬 월등합니다. 그러나, 수정을 대상으로 막을 부족 pCAG - tdTomato는 또한 잘 작동 (그림 1E). 또한, dextran 복합 형광 염료는 위에서 설명한 electroporation 프로토콜을 사용하여 레이블 RGCs하는 데 사용할 수 있습니다.
- 일반적으로, 10 주사 9 밖은 듀얼 플라스미드 방식으로, 표시 RGCs에 주사의 생각만이 약 15 %를 이끌 것이다표시되는 단 하나의 RGC의 결과. 성공적으로 가지 경우의 수는 한 눈에 여러 위치에 DNA를 주사하거나 각각의 눈 안으로 다른 형광 단백질을 인코딩 plasmids 주입을 증가 수 있습니다.
5. 대표 결과
RGC 라벨은 electroporation 후 24 시간에 의해 RGCs에서 EGFP 라벨과 P2에서 P25에 이르기까지 모든 연령대에서 준수하고 transfection 후 최소한 세 주 동안 표정을 유지했다.
찬란 분류 dendrites (그림 1A, B)와 단일 RGCs의 axonal 아보스 (그림 1 층)은 명확하게 시각 및 복원하실 수 있습니다.
외에도 RGCs에서이 기술은 같은 수평 세포, 양극 세포 및 다양한 amacrine 세포 subtypes (그림 1C) 등 다른 망막 세포 유형을 분류하는 데 사용할 수 있습니다
이 방법은 SC (그림 1E)에서 정상 retinotopy에 의해 입증 시각적인지도를 다듬 는다 정상적인 시간 과정을 방해하지 않습니다.
모든 연령대에서에서 가지 경우 90 %, pCAG - gapEGFP의 작은 볼륨 분사 (~ 2.3 - 4.6nL)는 몇 RGCs (그림 1D)에 표현되었다.
RGCs (그림 1A, B, D)와 같은 amacrine 같은 다른 세포 유형을 포함하는 하나의 망막 신경 세포의 라벨에 LED pCAG - Cre 호텔과 동물마다 pCAG - LNL - gapEGFP 조합 plasmids의 단일 주사를 사용하여 실험의 약 15 %에 세포 (그림 1C).
그림 1 - A, EGFP의 B. 예를 게시할 수 - 나탈 일 14 일 (P14)에서 평면 마운트 망막에있는 하나의 망막 신경절 세포를 (애로우 헤드가 축삭을 가리키는) 표시 P8에서 단일 스타 버스트 amacrine 세포의 C. 예 D.. . 오른쪽 눈이 인치 E. 도설 및 복부 RGCs P14에서 평면 마운트 망막에 RGCs 및 amacrine 세포를 포함하여 EGFP 분류 망막 뉴런의 클러스터는 electroporated와 EGFP와 왼쪽 눈 관자놀이와 복부 RGCs으로 표시 전기되었으며되었습니다 P1에서 tdTomato으로 표시. 라벨 RGCs에 의해 형성된 대상 지역 (별표)는 자신의 topographically 정확한 P9에서 SC의 위치 (전체 마운트, 흰색 개요)에서 볼 수 있습니다.에서는 RGC 아버 (2 - D 투영)라는 하나의 EGFP의 F. 예은 SC의 화살 섹션 (250 μm의 두께) (점선). 지혜로움에 대해에 이미지 (D)와 (F) 변환되었습니다 그레이 스케일과 반전합니다. 스케일 바 (μm의) : (A) - (D), (F) : 100, (E) : 500
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Discussion
이 비디오에서 우리는 생체내의 electroporation 프로토콜에을 입증되는 형광 단백질을 인코딩 DNA 구조와 출생 후의 생쥐의 망막 뉴런의 단일 또는 작은 클러스터의 라벨을 초래합니다. 이전 연구 그 electroporation 정상 RGC 축삭 아버 상세 검색을 방해하지 않았 의미, lipophilic 염료와 RGC 라벨을 사용하는 것과 dLGN와 SC에 찬란 분류 RGC 예측의 작은 클러스터는 유사한 프로젝션 패턴을 재현. 우리는 정상과 방해 영상지도와 함께 다양한 마우스 모델에서 단일 및 RGCs 그룹 모두의 수준에 retinotopic지도를 분석하는이 프로토콜을 이용합니다.
우리의 결과는 출생 후의 망막에있는 차별화된 망막 신경이 안정적으로 생체내 electroporation을 사용하여 transfected 수있다는 것을 보여준다. 생체내 electroporation 프로토콜의 출생 후의이 공간과 temporally 제한된 방식으로 동시 라벨링 및 RGCs의 유전자 조작을 허용 여기에서 설명한. 우리는 plasmids 인코딩 Cre 호텔 recombinase와 floxed STOP 시퀀스 앞에 형광 기자의 조합을 사용하여 망막 뉴런의 라벨을 보여줍니다. 일관된 단일 신경 세포의 transfection은 플라스미드 기자에 상대적으로 매우 낮은 농도 Cre 호텔 플라스미드를 사용하여 이루어진다. utero의 electroporation에에 비해이 방법은 덜 침략적이며 광학 chiasm에 이상 크로싱 같은 초기 축삭지도 행사 방해하지 않습니다. 또한, 바이러스 접근에 비해, 그것은 강한 유전자의 표현을위한 더 적은 시간이 필요하고 더 적은 독성이다. 이 도구는 모두 misexpression 통해 총 구조와 시냅스 수준이나 후보 유전자의 허물고 retinofugal 예측의 섬세한과 성숙을 중재 세포와 분자 메커니즘을 조사를위한 효율적이고 빠른 방법을 제공합니다. 생체내 대상 RGCs에서는 형광 라벨와 함께 생체내에서 사용할 수있는 두 개의 광자 RGC 축삭 역학과 생리적 특성 이미징. 요약, 유전자 표적 및 생체내에 RGCs을 시각화하는 능력은 postnatally 마우스 시각 시스템의 회로 개발을 관장하는 세포와 분자 메커니즘을 명료하게하다 더 도움이 될 것입니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
pCAG - gapEGFP 플라스미드 박사 S. 맥코넬 (스탠포드, CA)에서 선물했다. pCAG - tdTomato 플라스미드 박사 M. 펠러 (버클리, CA)에서 선물했다. 우리는 기술 지원을위한 시험 연구와 Crair 연구소 회원에 두 개의 플라스미드 Cre 호텔 / loxP 전략을 검증을위한 단일 셀 라벨 앤 Schohl (몬트리올, QC)에 대한 두 플라스미드 전략의 사용을 제안 박사의 에드워드 Ruthazer 감사합니다. R01 MH62639 (MC), NIH R01 EY015788 (MC)와 NIH P30 EY000785 (MC) 지원.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Electrical Stimulator | Grass Technologies | Model S4 | |
| Oscilloscope | Agilent Technologies | Model 54621A | |
| Audio monitor | Grass Technologies | Model AM8B | |
| Puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | |
| Vannas Scissors a | World Precision Instruments, Inc. | 14003 | |
| Micro Scissors b | Ted Pella, Inc. | 1347 | |
| Dumont AA Forceps c | Fine Science Tools | 11210-20 | |
| Nanoinject II System | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Glass Pipettes | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Foot pedal | Drummond Scientific | 3-000-026 | |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M3516 | |
| DiI | Invitrogen | D-383 | |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | D4551 |
References
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