Summary
Nós demonstramos uma
Abstract
A segmentação e refinamento das projeções para o mesencéfalo RGC é um sistema de modelo popular e poderosa para o estudo de como os padrões precisos de forma a conectividade neural durante o desenvolvimento. Em camundongos, as projeções retinofugal estão dispostos de uma forma topográfica e forma dos olhos específicas camadas no núcleo geniculado lateral (dLGN) do tálamo e colículo superior (SC). O desenvolvimento desses padrões precisos de projeções retinofugal tem sido tipicamente estudados pela rotulagem populações de RGCs com corantes fluorescentes e marcadores, tais como peroxidase 1-4. No entanto, estes métodos são muito grosseiro para fornecer informações sobre alterações de desenvolvimento em cada morfologia arbor RGC axonal que são a base da formação do mapa retinotopic. Eles também não permitem a manipulação genética de RGCs.
Recentemente, a eletroporação tornou-se um método eficaz para proporcionar o controle espacial e temporal preciso para entrega de moléculas carregadas na retina 11/05. Atuais protocolos de eletroporação da retina não permitem a manipulação genética eo rastreamento de projeções retinofugal de um único cluster ou pequena de RGCs em ratos pós-natal. Tem sido argumentado que a pós-natal em eletroporação in vivo não é um método viável para transfecting RGCs desde a rotulagem de eficiência é extremamente baixa e, portanto, requer a segmentação em idades embrionárias quando progenitores RGC são submetidos a diferenciação e proliferação 6.
Neste vídeo nós descrevemos um protocolo de eletroporação in vivo para a entrega prevista para genes, shRNA, e dextranos fluorescentes para RGCs murino pós-natal. Esta técnica proporciona um custo efetivo, rápido e relativamente fácil para plataforma de triagem eficiente de genes candidatos envolvidos em vários aspectos do desenvolvimento neural, incluindo retração axônio, ramificação, laminação, regeneração e formação de sinapses em vários estágios de desenvolvimento do circuito. Em resumo, descrevemos aqui uma valiosa ferramenta que irá fornecer mais ideias sobre os mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento mapa sensorial.
Protocol
1. Equipamentos de Set-up para Eletroporação
- Eletrodos: Nós modificamos Dumont # 5 pinça para uso como eletrodos.
- Separar e dividir o fórceps.
- Um fio de solda na ponta mais larga de cada dente. Enrole o fio ligado e dentes com fita isolante deixando aproximadamente 25-30 mm da ponta dos dentes expostos.
- Coloque a pinça modificada para trás junto com qualquer espaçador de plástico adequado (por exemplo um botão) entre os dois pinos para fornecer a ação da mola.
- Equipamentos elétricos: Usamos um estimulador elétrico para entregar pulsos de corrente para eletroporação e um monitor de áudio e osciloscópio para confirmar a forma de onda e número de pulsos a ser entregue.
- Conecte o fio de um pino da pinça para um pedal que também é ligado em série com o estimulador. O pedal funciona como um interruptor. Quando deprimidos que completa o circuito para eletroporação.
- Conecte o fio do pino de outras para o estimulador elétrico.
- Conecte o estimulador ao osciloscópio e monitorar o áudio.
- Micropipeta e injetor set-up: Nós usamos afiada pipetas de vidro e puxou o Nanoinject II sistema injetor para injetar volumes muito pequenos de corante ou solução DNA diretamente na retina.
- Montagem do sistema injector em um micromanipulador de 3 eixos.
- Puxe pipetas de vidro com uma vela de comprimento e pequena ponta.
- Voltar encher a pipeta puxado com óleo mineral e segura de injector (para detalhes ver manual de instruções Nanoinect II).
- Usando uma tesoura afiada microdissecting um corte a ponta da pipeta, criando uma pequena abertura (~ 2-3 mm).
- Encher a pipeta com a quantidade desejada de uma solução de injeção através da ponta da pipeta. Enquanto a integridade da ponta tem, ele pode ser usado para injeções múltiplas e animais.
Nota: i) Assegurar o suficiente solução injectável é carregado nas pontas de tal forma que o óleo mineral backfilled nunca é injetado no olho. ii) O Nanoinject II do sistema e do equipamento eletrônico específico utilizado neste vídeo não são críticas para a realização bem sucedida de rotulagem RGCs. Injeções feitas com outros dispositivos, como um picospritzer e eletroporação com outros estimuladores comum também pode ser usado para RGCs rótulo.
2. Soluções plasmídeo para Rotulagem RGC
- Para a rotulagem pequenos grupos de RGCs: Usamos uma construção de codificação EGFP (~ 2-3 mcg / mL) reforçada proteína verde fluorescente) sob o controle de um promotor de CAG (promotor de frango β-actina com uma imediata CMV enhancer precoce). EGFP é marcado com a seqüência de palmitoylation GAP-43 (crescimento associado a proteína-43) visando-lo para a membrana celular (mut4EGFP) 12. Esta construção é referido como pCAG-gapEGFP.
- Para a rotulagem única célula: Usamos uma combinação de duas construções. O primeiro vetor é um promotor CAG condução Cre recombinase (pCAG-Cre, Addgene [Cambridge, MA] plasmídeo 13775) 13 eo segundo vetor contém uma cassete PARAR floxed seguido por membrana alvo EGFP (pCAG-LNL-gapEGFP). pCAG-Cre (~ 0.15-ng/μL) é utilizado na concentração de aproximadamente 1.000-10.000 vezes menor que pCAG-LNL-gapEGFP (~ 1-2 μgμL), confinando EGFP expressão forte para um pequeno número de células (por força da a relativamente baixa concentração pCAG-Cre).
3. Injeção de retina e Protocolo Eletroporação
- Dia pós-natal 0 (P0) para filhotes P5 são anestesiados por hipotermia, enquanto os ratos mais velhos do que P5 são anestesiados com uma injeção intraperitoneal (0,7 ml / kg) de um coquetel de cetamina (4,28 mg / mL), xilazina (0,82 mg / ml) e acepromazina (0.07mg/ml) 14.
- Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos e dicas de eletrodos em um esterilizador talão quente. Posteriormente fresco tanto em solução salina estéril antes do uso para evitar danos térmicos aos olhos.
- Colocar o mouse em um escopo dissecção e posição do injetor.
- Para camundongos com idade inferior a P14 (antes da abertura dos olhos), cirurgicamente abrir a pálpebra, cortando toda a extensão da abertura da pálpebra futuro com micro dissecação b tesoura primavera.
- Faça o globo ocular se projetam parcialmente suavemente aplicar pressão ao redor do olho com as pontas dos forceps c.
- Mantenha o olho no lugar por beliscar suavemente a pele ao redor do globo ocular.
- Ajuste micromanipulador e trazer pipeta junto ao globo ocular.
- Pressione pedal, que é ligado à II Nanoinject sistema, para expelir algumas gotas de solução de injeção e, assim, verificar se a pipeta não está entupido.
- Com uma mão estabilizar o globo ocular, mova o micromanipulador de tal forma que a ponta da pipeta de vidro perfura através do epitélio pigmentar da retina e entra na retina.
- Injetar desIRED quantidade de solução pressionando o pedal para o sistema II Nanoinject. Por exemplo, para rotular RGCs única fazemos uma única injeção de 2,3 4.6nL.
- Retrair a pipeta e coloque cuidadosamente dicas eletrodo diretamente sobre o local da injeção e deprimem pedal de estimulador para completar o circuito e electroporate o olho. Normalmente usamos pulsos quadrados com as configurações de força de 25V, 50mseg duração, além 1seg. 10 pulsos (5 pulsos de cada polaridade) são aplicados pulsos para os ratos com mais de P4 e 6 (3 pulsos de cada polaridade) são aplicados para P0 a P3 ratos.
- Com cuidado, empurre para trás do globo ocular no soquete e aplicar pomada oftálmica estéril sobre as pálpebras cortadas.
- Animais lugar sobre uma almofada de calor com temperatura controlada e em recuperação completa, incluindo o reaquecimento adequado e mobilidade, o retorno dos animais à sua mãe.
- Monitorar os animais a cada 12 horas para qualquer sinal de sofrimento, dor ou desconforto, como perda de mobilidade, postura anormal ou falta de noivo. Repetidas rodadas de anestesia, injecções e eletroporação não deve ser realizada no mesmo animal.
4. Notas
- O método de injeção descritos neste vídeo é uma injeção de 'cego'. É possível visualizar a quantidade e localização de injeção quando se trabalha com ratos albinos e soluções coloridas (DII ou solução plasmídeo com traços de azul rápido). No entanto, com cepas pigmentadas ratos no local de injeção não pode ser diretamente visualizado e, portanto, é difícil descrever verbalmente se alguém chegou ao local pretendido retina ou quão longe se deve mover-se a pipeta para atingir a camada de RGC especificamente. Por isso, aconselhamos os novos usuários a começarem com injeções de DII em ratos albinos uma vez que estas injecções podem ser visualizados imediatamente no retina e à rotulagem das projeções RGC para a retina e do cérebro podem ser usados para avaliar a qualidade de injeção. Prepare DII 10% em N, N-Dimetilformamida (100%) para injectáveis focal. Usuários uma vez que este procedimento é dominado deve ser capaz de consistentemente alvo RGCs com soluções claras DNA plasmídeo em ratos pigmentados.
- O método de injeção descritos neste vídeo pode ser usado para fazer injeções focal DII para rotular pequenas populações de células para estudo retinotopy (4.6nL etiquetas de algumas centenas RGCs) 14 e RGCs rótulo granel com fluoróforos (Alexa555, 488 etc), conjugada com subunidade B da toxina da cólera para estudar olho específico de segregação, excluindo o passo eletroporação em # 10 acima. Um volume de injeção máxima total de 2-3uL de ratos mais velhos do que P14 e 1-2uL para camundongos com idade inferior a P14 de qualquer solução é recomendada.
- Pipetas podem ser backfilled com soluções a ser injetado seguido de preenchimento com óleo mineral antes de montar a pipeta no injector e quebrar a ponta. Isto é especialmente útil quando se utiliza soluções alta concentração de DNA (~ 6ug/uL), que são em geral muito viscoso e difícil de carga da ponta da pipeta.
- Se a pipeta de vidro se torna obstruído, limpe cuidadosamente a ponta da pipeta com um cotonete embebido em água para soluções de DNA e de etanol (100%) para a tintura (DII) soluções.
- Depois de injetar no olho, retirar a ponta da pipeta do globo ocular e pressione o pedal para injetar novamente. Isto é para confirmar que a ponta não ficar entupidos durante o processo de injeção. Se nenhuma solução for distribuído, é bastante provável que a injeção não foi bem sucedida. No entanto, isso não deve ser tomado como um sinal de absoluta de que a injecção não foi bem sucedida. O experimentador pode injetar o mesmo olho novamente se locais de injecção múltipla e rotulagem de maior número de células é desejada.
- Para a rotulagem RGCs único, definir a velocidade de injeção para retardar na caixa de controle Nanoinject. Isso reduz ainda mais a quantidade de solução injetada na retina como o sistema demora mais tempo a essa configuração para dispensar a solução ao mesmo tempo, a ponta do pipetas de vidro está sendo recolhida rapidamente a partir do globo ocular.
- Eletroporação do dia pós-natal 0-3 (P0 a P3) ratos exige cuidados adicionais, pois é muito fácil danificar o olho (isto se torna evidente depois de alguns dias de recuperação, quando o olho é comprovadamente menor que o normal). Redução do número de pulsos e tensão aplicada é aconselhável para o início de ratos neonatal. Depois de P4, os globos oculares são mais resistentes aos danos da eletroporação.
- Em nossa experiência versões membrana alvo de EGFP ou RFP ('gapEGFP, ver 12) são muito superiores a GFP não modificada para o exame retinofugal projeções para o cérebro. No entanto, pCAG-tdTomato, que carece de uma membrana alvo de modificação, também funciona bem (Figura 1E). Além disso, dextran conjugados corantes fluorescentes também podem ser usados para RGCs etiqueta usando o protocolo de eletroporação descrito acima.
- Tipicamente, 9 em cada 10 injeções levará a RGCs rotulados, embora apenas cerca de 15% das injeções com a abordagem dupla plasmídeo iráresultado em apenas um único RGC ser rotulado. O número de casos de sucesso pode ser aumentada através da injeção de DNA em vários locais em um olho ou pela injeção de plasmídeos codificação de diferentes proteínas fluorescentes em cada olho.
5. Resultados representante
RGC rotulagem foi observada em todas as idades, variando de P2 para P25, com EGFP rotulagem em RGCs por 24 horas após a eletroporação e mantido expressão para, pelo menos, três semanas após transfecção.
Dendrites fluorescente etiquetado (Figura 1A, B) e mandris axonal (Figura 1F) de RGCs única pode ser claramente visualizado e reconstruído.
Além de RGCs, esta técnica pode ser usada para rotular outros tipos de células da retina, tais como células horizontais, células bipolares e amácrinas vários subtipos de células (Figura 1C)
Este método não interfere com o curso do tempo normal de refinamento mapa visual como demonstrado por retinotopy normal na SC (Figura 1E).
Em todas as idades, em cerca de 90% dos casos, uma injeção de pequeno volume (~ 2,3 4.6nL) de pCAG-gapEGFP levou a expressão em uma RGCs poucos (Figura 1D).
Em aproximadamente 15% dos ensaios utilizando uma única injeção da pCAG-Cre e plasmídeos pCAG-LNL-gapEGFP combinação por animal, levou a rotulagem único neurônio da retina, incluindo RGCs (Figura 1A, B, D) e outros tipos de células, tais como amácrinas células (Figura 1C).
Figura 1 - A, B. Exemplos de EGFP rotulados única células ganglionares da retina (cabeça de seta apontando para axônio) em um flat-mount retina no pós-natal dia 14 (P14) C. Exemplo de célula única amácrinas starburst em P8 D.. . Um conjunto de EGFP rotulados neurônios da retina, incluindo RGCs e células amácrinas em retina flat-mount at P14 RGCs. E. dorsais e ventrais no olho direito foram electroporated e rotuladas com EGFP e RGCs temporal e ventral no olho esquerdo foram galvanizados e rotulados com tdTomato em P1. As zonas alvo (asteriscos) formado pela RGCs rotulado pode ser visto em seu local topograficamente correto no SC em P9 (todo-mount, o contorno branco). F. Exemplo de um único EGFP rotulados RGC arbor (2-D de projeção), em uma seção sagital (250 mm de espessura) do SC (linha pontilhada). Para maior clareza, imagens em (D) e (F) foram convertidas para tons de cinza e invertida. Barras de escala (mm): (A) - (D), (F): 100; (E): 500
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Discussion
Neste vídeo mostramos um protocolo de eletroporação in vivo que resulta em rotulagem de clusters único ou pequeno de neurônios da retina em ratos pós-natal com as construções de DNA que codificam proteínas fluorescentes. Pequenos grupos de fluorescente etiquetado projeções para o RGC dLGN e SC reproduzida padrões projeção semelhante como estudos anteriores usando rotulagem RGC com corantes lipofílicos, indicando que eletroporação não interferiu normais RGC refinamento arbor axônio. Nós utilizamos esse protocolo para analisar o mapa retinotopic ao nível de ambos solteiros e grupos de RGCs em modelos de ratos com vários normal e perturbado mapas visual.
Nossos resultados demonstram que os neurônios da retina diferenciada na retina pós-natal pode ser confiavelmente transfectadas usando em eletroporação in vivo. A pós-natal in vivo eletroporação protocolo descrito aqui permite a rotulagem simultânea e manipulação genética de RGCs de uma forma espacialmente e temporalmente restrita. Demonstramos rotulagem de neurônios da retina usando uma combinação de codificação de plasmídeos Cre recombinase e repórter fluorescente precedido pela seqüência PARAR floxed. Transfecção neurônio único consistente é conseguido através de muito baixa concentração Cre plasmídeo em relação ao plasmídeo repórter. Em comparação com a eletroporação utero, este método é menos invasivo e não interfere com os eventos axônio início de orientação, tais como cruzar no quiasma óptico. Além disso, em relação às abordagens viral, ela requer menos tempo para a expressão do gene é forte e menos tóxicos. Esta ferramenta fornece um meio eficiente e rápido para examinar os mecanismos celulares e moleculares mediar o refinamento ea maturação das projeções retinofugal tanto a nível estrutural e bruta sináptica através da misexpression ou derrubar de genes candidatos. In vivo RGCs alvo com uma etiqueta fluorescente também pode ser usado para in vivo de dois fótons de imagem de RGC axônio dinâmica e suas propriedades fisiológicas. Em resumo, a capacidade de geneticamente alvo e visualize RGCs in vivo após o parto ajudará a elucidar os mecanismos celulares e moleculares que regem o desenvolvimento de circuitos no sistema do mouse visual.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
O plasmídeo pCAG-gapEGFP foi um presente do Dr. S. McConnell (Stanford, CA). pCAG-tdTomato plasmídeo foi um presente do Dr. M. Feller (Berkeley, CA). Agradecemos ao Dr. Edward Ruthazer para sugerir o uso de uma estratégia de duas plasmídeo para a rotulagem única célula e Schohl Anne (Montreal, QC) para validar os dois plasmídeo estratégia Cre / loxP em estudos-piloto e membros de laboratório Crair para suporte técnico. Apoiada por R01 MH62639 (MC), NIH R01 EY015788 (MC) e NIH P30 EY000785 (MC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Electrical Stimulator | Grass Technologies | Model S4 | |
| Oscilloscope | Agilent Technologies | Model 54621A | |
| Audio monitor | Grass Technologies | Model AM8B | |
| Puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | |
| Vannas Scissors a | World Precision Instruments, Inc. | 14003 | |
| Micro Scissors b | Ted Pella, Inc. | 1347 | |
| Dumont AA Forceps c | Fine Science Tools | 11210-20 | |
| Nanoinject II System | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Glass Pipettes | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Foot pedal | Drummond Scientific | 3-000-026 | |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M3516 | |
| DiI | Invitrogen | D-383 | |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | D4551 |
References
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