Summary
Мы демонстрируем
Abstract
Адресности и уточнение РГК проекции среднего мозга является популярным и мощным модельной системы для изучения того, как точной модели нейронной форма связи в процессе разработки. У мышей, retinofugal прогнозы расположены в топографических порядке и по форме глаз конкретных слоев наружного коленчатого тела (dLGN) таламуса и верхний бугорок (SC). Развитие этих точных моделей retinofugal прогнозы как правило, были изучены маркировки популяций РГК с флуоресцентными красителями и индикаторов, таких, как пероксидаза хрена 1-4. Однако, эти методы слишком грубы, чтобы дать представление о развитии изменений в отдельные РГК аксонального морфологии беседки, которые являются основой retinotopic формирование карты. Они также не позволяют генетические манипуляции РГК.
В последнее время электропорации стала эффективным методом для обеспечения точной пространственной и временной контроль на поставку заряженных молекул в сетчатку 5-11. Текущий сетчатки протоколов электропорации не позволяют генетических манипуляций и отслеживание retinofugal проекции одного или небольшой кластер РГК в постнатальном мышей. Утверждалось, что в послеродовом электропорации естественных условиях не является жизнеспособным методом трансфекции РГК с маркировки эффективность крайне мала и, следовательно, требует ориентации на эмбриональном возрасте, когда RGC прародителей проходят дифференциации и пролиферации 6.
В этом видео мы описываем в естественных условиях электропорации протокол для адресной доставки генов, shRNA и флуоресцентные декстраны с мышиным РГК постнатально. Эта техника представляет собой экономически эффективный, быстрый и относительно легко платформу для эффективного скрининга генов-кандидатов, участвующих в нескольких аспектах развития нервной системы, включая аксон опровержение, ветвящийся, ламинирование, регенерацию и формирование синапса на различных этапах схемы развития. В заключение мы описываем здесь ценным инструментом, который обеспечит более полное представление о молекулярных механизмах основной сенсорное развитие карте.
Protocol
1. Подключение оборудования для Электропорация
- Электроды: Мы изменили Дюмон # 5 щипцы для использования в качестве электродов.
- Отдельные и развалится щипцами.
- Паяльной проволоки на широкий конец каждого зубца. Оберните провод прилагается и зубцами изоляционной лентой оставляя примерно 25-30 мм кончика зубца подвергается.
- Положите изменение щипцы обратно вместе с любым подходящим Spacer пластика (например, кнопка) между двумя зубцами, чтобы обеспечить весной действия.
- Электротехническое оборудование: Мы используем электрический стимулятор для доставки импульсов тока для электропорации и осциллограф и звуковой монитор для подтверждения сигнала и количество импульсов поставляются.
- Подключите провод от одного зубца щипцы для ножной педали, который также соединен последовательно с стимулятора. Ножная педаль действует как переключатель. При депрессии он завершает схему электропорации.
- Подключите провод от друга зубцами к электрическим стимулятором.
- Подключите стимулятор для осциллографов и аудио монитора.
- Микропипетки и инжектор настройки: Мы используем резкие вытащил стекло пипетки и Nanoinject II инжекторной системы для введения очень малых объемах краситель или раствора ДНК непосредственно в сетчатке.
- Горы инжекторной системы на 3-х осевой микроманипулятора.
- Вытяните стекло пипетки с длинным конусом и небольшая заметка.
- Вернуться заполнить вытащил пипетки с минеральным маслом и безопасной для инжектора (подробнее см. Nanoinect II руководства).
- Использование резкого microdissecting ножницами вырезать кончиком пипетки, создавая небольшое отверстие (~ 2-3 мкм).
- Заполните пипетку с желаемым количеством раствора для инъекций через кончик пипетки. Пока целостность наконечник имеет место, она может быть использована для нескольких инъекций и животных.
Примечание: я) обеспечить достаточно инъекционного раствора загружается в советы, что засыпана минеральное масло никогда не вводили в глаз. II) Nanoinject II системы и конкретного электронного оборудования, используемого в этом видео не являются критическими для достижения успешных маркировки РГК. Инъекции сделали с другими устройствами, такими как picospritzer и электропорации с другими общими стимуляторами может также использоваться для обозначения РГК.
2. Плазмиды решения для маркировки РГК
- Для маркировки небольших кластеров РГК: Мы используем построить кодирования EGFP (~ 2-3 мкг / мкл) улучшенный зеленый флуоресцентный белок) под контролем промотора CAG (курица β-актин промотора CMV немедленного рано усилитель). EGFP помечается palmitoylation последовательность GAP-43 (рост связан белок-43), ориентированная на ее клеточной мембраны (mut4EGFP) 12. Эта конструкция называется pCAG-gapEGFP.
- Для одиночных маркировки ячейки: Мы используем комбинацию двух конструкций. Первый вектор CAG промоутер вождения Cre рекомбиназы (pCAG-Cre, Addgene [Кембридж, Массачусетс] плазмиды 13775) 13, а второй вектор содержит floxed кассету СТОП затем мембраны целевых EGFP (pCAG-LNL-gapEGFP). pCAG-Cre (~ 0.15-ng/μL) используется примерно в 1000-10000 раз меньшей концентрации, чем pCAG-LNL-gapEGFP (~ 1-2 μgμL), ограничиваясь сильное выражение EGFP на небольшое число клеток (в силу относительно низкие pCAG-Cre концентрации).
3. Сетчатки инъекция и Электропорация протокола
- Послеродовая день 0 (P0) до П5 щенки наркозом путем переохлаждения, в то время как мыши старше P5 анестезируют с внутрибрюшинного введения (0,7 мл / кг) коктейль кетамина (4,28 мг / мл), ксилазина (0,82 мг / мл) и acepromazine (0.07mg/ml) 14.
- Стерилизовать всех хирургических инструментов и электродов советы в горячей стерилизатор шарик. Впоследствии прохладно, как в стерильного физиологического раствора перед использованием, чтобы избежать термического повреждения глаз.
- Наведите под сферу рассечение и положение инжектора.
- Для мышей моложе P14 (до открытия глаз), открытым хирургическим путем сокращения веко по всей длине будущего открытие века с микро рассекает б весной ножницами.
- Сделать глазного яблока частично выступают, мягко нажимая вокруг глаз кончиками пинцета с.
- Держите глаз на место, осторожно щипать кожу вокруг глаз.
- Отрегулируйте микроманипулятора и привести пипетку близко к глазному яблоку.
- Пресс ножной педали, которая подключается к Nanoinject II системе, исключить несколько капель раствора для инъекций и, таким образом убедиться, что пипетка не засорен.
- С одной стороны, стабилизирующий глазного яблока, двигаться микроманипулятора так, что кончик стеклянной пипетки проникает сквозь пигментный эпителий сетчатки и входит в сетчатке.
- Inject деIRED количество раствора, нажав педаль для системы Nanoinject II. Например, для обозначения одного РГК мы делаем однократное введение 2,3-4.6nL.
- Уберите пипетки и осторожно поместите электрод советы прямо над инъекции и нажмите педаль для стимулятор для завершения схемы и electroporate глаз. Мы обычно используют прямоугольные импульсы с настройками 25В силу, 50msec продолжительность, 1 сек друг от друга. 10 импульсов (5 импульсов каждой полярности) применяются для мышей старше P4 и 6 импульсов (3 импульсов каждой полярности) применяются для Р0 на P3 мышей.
- Аккуратно нажмите глазное яблоко обратно в гнездо и применять мазь стерильной глазной более сократить веки.
- Место животных на контролируемой температурой площадку тепла и на полное восстановление, включая адекватное согревание и мобильности, возвращение животных к матери.
- Монитор животных каждые 12 часов для каких-либо признаков боли, страдания или дискомфорта, таких как потеря подвижности, нарушение позы или отказ жениха. Повторные раунды анестезии, инъекции и электропорации не должны проводиться на тех же животных.
4. Примечания
- Метод инъекции, описанные в этом видео "слепой" инъекции. Можно представить себе размер и расположение инъекции при работе с белых мышах и цветные растворы (DII или плазмиды решение с следовые количества быстро синий). Тем не менее, с пигментными штаммов мышей инъекции место не может быть непосредственно визуализировать и, следовательно, трудно устно описать ли один достиг предназначен сетчатки место или, как далеко следует двигаться пипеткой целевой РГК слоя в частности. Поэтому мы настоятельно рекомендуем новым пользователям начать с инъекциями DII в белых мышей, так как эти инъекции могут быть немедленно визуализируются в сетчатке и маркировки РГК проекции на сетчатку и мозг могут быть использованы для оценки качества инъекции. Подготовка 10% DII в N, N-диметилформамиде (100%) для координационных инъекций. Как только эта процедура осваивается пользователи должны иметь возможность последовательно целевой РГК с четкими ДНК плазмиды решения в пигментированных мышей.
- Метод инъекции, описанные в этом видео может быть использован для инъекций координационного DII для обозначения небольших популяций клеток для изучения retinotopy (4.6nL этикетки нескольких сотен РГК) 14 и для массовой РГК этикетка с флуорофоров (Alexa555, 488 и т.д.) конъюгированные с субъединицы холерного токсина B для изучения глаза конкретных сегрегации, за исключением электропорации шаг в № 10 выше. Максимальный общий объем инъекций 2-3uL для мышей старше P14 и 1-2UL для мышей моложе P14 любого решения рекомендуется.
- Пипетки могут быть засыпаны с растворами для инъекций следует засыпка минеральным маслом перед установкой пипетки на инжекторе и нарушение кончиком. Это особенно полезно при использовании высоких концентраций растворов ДНК (~ 6ug/uL), которые вообще очень вязкой и трудно нагрузки от кончика пипетки.
- Если стеклянную пипетку засоряется, тщательно протрите пипетки с помощью ватного тампона, смоченной в воде для растворов ДНК и этанола (100%) для красителя (DII) решений.
- После введения в глаза, отказаться от пипетки глазного яблока и нажмите педаль вводить снова. Это подтверждение того, что чаевые не забиваться во время процесса впрыска. Если же никакого решения не обойтись, то вполне вероятно, что инъекции не увенчались успехом. Однако это не следует воспринимать как признак того, что абсолютное инъекции не увенчались успехом. Экспериментатор может придать тот же глаз еще раз, если несколько узлов впрыска и маркировки большее число клеток лучшего.
- Для маркировки одного РГК, установить скорость впрыска, чтобы замедлить на блок управления Nanoinject. Это еще больше снижает количество раствора вводят в сетчатке, что и система требует больше времени на этот параметр, чтобы обойтись без решения одновременно кончик стеклянной пипетки втягивается быстро от глазного яблока.
- Электропорация постнатального день 0 до 3 (P0 до Р3) мышей требует дополнительного ухода, так как очень легко повредить глаза (это становится очевидным после нескольких дней на восстановление, когда глаз явно меньше, чем обычно). Уменьшение количества импульсов и напряжения рекомендуется для ранней неонатальной мышей. После P4, глазные яблоки более устойчивыми к повреждениям от электропорации.
- По нашему опыту мембраны целевых версий EGFP или RFP ('gapEGFP', см. 12) гораздо выше, немодифицированные GFP для изучения retinofugal прогнозы в мозг. Тем не менее, pCAG-tdTomato, в котором отсутствуют мембраны ориентации модификации, также хорошо работает (рис. 1E). Кроме того, декстран сопряженных флуоресцентные красители могут также использоваться для обозначения РГК использованием электропорации протокол, описанный выше.
- Как правило, в 9 из 10 инъекций приведет к помечены РГК, хотя только около 15% инъекций с двойным плазмиды подход будетрезультате всего за один РГК быть маркированы. Ряд успешных случаях может быть увеличена путем введения ДНК в нескольких местах на один глаз или путем введения плазмид, кодирующих различные флуоресцентные белки в каждый глаз.
5. Представитель Результаты
RGC маркировки наблюдалось во всех возрастных группах, начиная от P2 до P25 с EGFP маркировки в РГК по 24 часа после электропорации и поддерживается выражением, по крайней мере три недели после трансфекции.
Флуоресцентно меченных дендритов (рис. 1а, б) и аксонального беседки (рис. 1F) одного РГК могут быть четко визуализировать и реконструированы.
Кроме РГК, этот метод может быть использован для обозначения других типов клеток сетчатки, таких как горизонтальные клетки, биполярные клетки и различные подтипы amacrine ячейки (рис. 1C)
Этот метод не влияет на нормальный ход времени визуального уточнения карты о чем свидетельствует нормальное retinotopy в SC (рис. 1E).
На всех возрастов, примерно в 90% случаев, небольшие объемом впрыска (~ 2,3-4.6nL) из pCAG-gapEGFP привело к выражение в нескольких РГК (рис. 1D).
Примерно в 15% испытаний с использованием однократного введения pCAG-Cre и pCAG-LNL-gapEGFP комбинации плазмид на одно животное, привели к одной сетчатки маркировки нейрона в том числе РГК (рис. 1А, В, D) и другие типы клеток, такие как amacrine клетки (рис. 1в).
Рисунок 1 -, Б. Примеры EGFP помечены одним ганглиозных клеток сетчатки (стрелки, указывающие на аксон) в плоской горы сетчатку в послеродовой день 14 (P14) C. Пример одной клетки amacrine звездообразования в P8 D.. . кластер EGFP меченых нейронов сетчатки в том числе РГК и amacrine клеток плоского монтажа сетчатки на P14. Е. Спинной и брюшной РГК в правом глазу были электропорации и маркированы с EGFP и временной и брюшной РГК в левый глаз были гальваническим и помечены tdTomato на P1. Целевые зоны (звездочки), образованный помечены РГК можно увидеть в их топографически правильное расположение в СК при Р9 (весь монтаж, белый контур). F. Пример одного EGFP помечены РГК беседка (2-D проекции) в сагиттальном сечении (250 мкм) из SC (пунктирная линия). Для наглядности изображения (D) и (F) были преобразованы в оттенки серого и перевернутый. Шкала баров (мкм): () - (D), (F): 100; (Е): 500
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом видео мы демонстрируем в протокол электропорации естественных условиях, что приводит к маркировке одного или небольших групп нейронов сетчатки в постнатальном мышей с ДНК-конструкции кодирования флуоресцентных белков. Малые кластеры флуоресцентно меченных РГК проекции на dLGN и СК воспроизведены аналогичные модели проекции, как и предыдущие исследования с использованием RGC маркировки с липофильных красителей, указывая, что электропорации не мешали нормальной РГК уточнение аксон беседке. Мы использовали этот протокол для анализа retinotopic карту на уровне как отдельных лиц и групп из РГК в различных моделях мышей с нормальной и нарушенной визуальной карты.
Наши результаты показывают, что дифференцированных нейронов сетчатки в послеродовом сетчатки могут быть надежно трансфицированных использованием в естественных условиях электропорации. Послеродового в естественных условиях электропорации протокол, описанный здесь, позволяет одновременно маркировки и генетических манипуляций РГК в пространстве и во времени ограничено образом. Мы демонстрируем маркировки нейронов сетчатки с помощью комбинации плазмид кодирования Cre рекомбиназы и люминесцентных репортер предшествовала floxed последовательность STOP. В соответствии одного нейрона трансфекция достигается за счет использования крайне низкой Cre плазмиды концентрации по отношению к репортеру плазмиды. По сравнению с электропорации в матке, этот метод является менее инвазивным и не вмешивается в раннем аксон руководством такие события, как переход через в зрительных нервов. Кроме того, по отношению к вирусным подходы, она требует меньше времени для сильных экспрессии генов и менее токсичен. Этот инструмент обеспечивает эффективное и быстрое средство для изучения клеточных и молекулярных механизмов посредническую изысканность и созревание retinofugal прогнозы как на валовой структурных и синаптических уровне через misexpression или сбить генов-кандидатов. В естественных условиях ориентации РГК с флуоресцентной метки также может быть использован для в естественных условиях двухфотонного изображения РГК аксон динамики и их физиологические свойства. Таким образом, способность к генетически цели и визуализировать РГК в естественных условиях постнатально будет способствовать дальнейшему выяснить клеточные и молекулярные механизмы, регулирующие схемы развития в мышь зрительной системы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
PCAG-gapEGFP плазмиду подарок от д-р С. Макконнелл (Стэнфорд, Калифорния). pCAG-tdTomato плазмиду подарок от д-ра М. Феллер (Беркли, Калифорния). Мы благодарим д-р Эдвард Ruthazer за предложение использование двух плазмид стратегии для одной маркировки клеток и Энн Schohl (Montreal, QC) для проверки двух плазмид Cre / loxP стратегии в экспериментальных исследованиях и членов Crair лабораторию для технической поддержки. Поддержка R01 MH62639 (MC), NIH R01 EY015788 (MC) и NIH P30 EY000785 (МК).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Electrical Stimulator | Grass Technologies | Model S4 | |
| Oscilloscope | Agilent Technologies | Model 54621A | |
| Audio monitor | Grass Technologies | Model AM8B | |
| Puller | Sutter Instrument Co. | Model P-97 | |
| Vannas Scissors a | World Precision Instruments, Inc. | 14003 | |
| Micro Scissors b | Ted Pella, Inc. | 1347 | |
| Dumont AA Forceps c | Fine Science Tools | 11210-20 | |
| Nanoinject II System | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Glass Pipettes | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| Foot pedal | Drummond Scientific | 3-000-026 | |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M3516 | |
| DiI | Invitrogen | D-383 | |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | D4551 |
References
- Huberman, A. D., Feller, M. B., Chapman, B. Mechanisms underlying development of visual maps and receptive fields. Annu Rev Neurosci. 31, 479-509 (2008).
- McLaughlin, T., Torborg, C. L., Feller, M. B., O'Leary, D. D. Retinotopic map refinement requires spontaneous retinal waves during a brief critical period of development. Neuron. 40, 1147-1160 (2003).
- Godement, P., Salaun, J., Imbert, M. Prenatal and postnatal development of retinogeniculate and retinocollicular projections in the mouse. J Comp Neurol. 230, 552-575 (1984).
- Jaubert-Miazza, L. Structural and functional composition of the developing retinogeniculate pathway in the mouse. Vis Neurosci. 22, 661-676 (2005).
- Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation. BMC Dev Biol. 7, 103-103 (2007).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Analysis of gene function in the retina. Methods Mol Biol. 423, 259-278 (2008).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. J Vis Exp. , (2009).
- Ishikawa, H. Effect of GDNF gene transfer into axotomized retinal ganglion cells using in vivo electroporation with a contact lens-type electrode. Gene Ther. 12, 289-298 (2005).
- Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J Vis Exp. , (2008).
- Ruthazer, E. S., Haas, K., Javaherian, A., Jensen, K., Sin, W. C., Cline, H. T. In vivo time- lapse imaging of neuronal development. Imaging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual. Yuste, R., Konnerth, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 191-204 Forthcoming.
- Kachi, S., Oshima, Y., Esumi, N., Kachi, M., Rogers, B., Zack, D. J., Campochiaro, P. A. Nonviral ocular gene transfer. Gene Ther. 12, 843-851 (2005).
- Okada, A., Lansford, R., Weimann, J. M., Fraser, S. E., McConnell, S. K. Imaging cells in the developing nervous system with retrovirus expressing modified green fluorescent protein. Exp Neurol. 156, 394-406 (1999).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 1027-1032 (2007).
- Plas, D. T. morphogenetic proteins, eye patterning, and retinocollicular map formation in the mouse. J Neurosci. 28, 7057-7067 (2008).
