Summary
क्रमादेशित कोशिका मृत्यु assays आमतौर पर डीएनए laddering या TUNEL के assays, जैसे स्तनधारी प्रणालियों में इस्तेमाल किया अक्सर पौधों में पुन: पेश करने के लिए मुश्किल है. एक गस संवाददाता प्रणाली के साथ संयोजन में, हम एक तेजी से, संयंत्र आधारित क्षणिक विशिष्ट जीन की संभावित मौत गुण का विश्लेषण परख का प्रस्ताव.
Abstract
हम एक उपन्यास क्षणिक संयंत्र अभिव्यक्ति प्रणाली है कि एक साथ रिपोर्टर जीन, β glucuronidase (गस), कोशिका मृत्यु के ख्यात सकारात्मक या नकारात्मक नियामकों के साथ व्यक्त विकसित किया है. इस प्रणाली में एन, benthamiana पत्ते हैं एक 35S संचालित अभिव्यक्ति विश्लेषण किया जा जीन युक्त कैसेट के साथ सह - घुसपैठ, और एक वाहन के रूप में गस वेक्टर pCAMBIA 2301 Agrobacterium तनाव LBA4404 का उपयोग. क्योंकि जीवित कोशिकाओं के लिए गस अभिव्यक्ति होती आवश्यक हैं, गस गतिविधि के नुकसान जब इस मार्कर जीन कोशिका मृत्यु का सकारात्मक नियामकों के साथ सह व्यक्त की उम्मीद है. समान रूप से, गस गतिविधि में वृद्धि हुई है मनाया जब विरोधी apoptotic जीन वेक्टर नियंत्रण की तुलना में उपयोग किया जाता है. जैसा कि नीचे दिखाया गया है, हम सफलतापूर्वक हमारे प्रयोगशाला में इस प्रणाली के इस्तेमाल के लिए दोनों के समर्थक और विरोधी मौत के खिलाड़ियों का विश्लेषण. ये विरोधी apoptotic संयंत्र परिवार बीसीएल-2 एसोसिएटेड athanoGene (बैग), के रूप में के रूप में अच्छी तरह से, जैसे BAX कोशिका मृत्यु के स्तनधारी inducers जाना जाता है, शामिल हैं. इसके अतिरिक्त, हम इस प्रणाली का इस्तेमाल किया विशिष्ट truncations के प्रोटीन के भीतर मृत्यु समारोह है, जो संभव बाद translational / इन प्रोटीनों के संशोधन सक्रियण पर सुराग प्रदान कर सकता का विश्लेषण. यहाँ, हम विशिष्ट जीन की मौत समारोह की जांच में एक प्रारंभिक कदम के रूप में एक तेजी से और संवेदनशील संयंत्र आधारित पद्धति प्रस्तुत करते हैं.
Protocol
Nicotiana benthamiana पौधों को 25 डिग्री सेल्सियस पर एक तापमान नियंत्रित विकास कक्ष में बड़े हो रहे हैं . 3-6 हफ्ते पुरानी पौधों की पूरी तरह से स्वस्थ पत्तियों का विस्तार किया जाता है.
सुझाव: नए उभरते पत्तियों का उपयोग करके बेहतर परिणाम प्राप्त कर रहे हैं
1. Agrobacterium क्षणिक घुसपैठ प्रोटोकॉल:
दिवस 1
- स्ट्रीक लेग / रिफैम्पिसिन (25 μg / मिलीलीटर) / (100 μg / एमएल) Kanamycin Agrobacterium tumefaciens (LBA4404 तनाव) (ओं) जीन कोशिका मृत्यु के लिए assayed हो और युक्त वेक्टर के साथ उचित वैक्टर युक्त ग्लिसरॉल शेयरों के साथ अगर प्लेटें एक विधान प्रमोटर के तहत गस कैसेट. हमेशा एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक खाली वेक्टर नियंत्रण शामिल हैं.
- 28 ° 2 दिनों के लिए सी सेते हैं.
3 दिन
- प्रत्येक लेग / / रिफैम्पिसिन Kanamycin थाली पहले रेखादार से एक एकल कॉलोनी के साथ रिफैम्पिसिन (25 μg / मिलीलीटर) और Kanamycin (100 μg / मिलीलीटर) युक्त लेग 2 मिलीलीटर टीका लगाना.
- 28 में मिलाते ° C 200 rpm पर 24 घंटे के लिए अधिकतम वृद्धि घनत्व तक पहुँच है द्वारा प्रत्येक संस्कृति को सेते हैं.
युक्ति: clumping कभी कभी मनाया जाता है, जो मामले में संस्कृतियों के लिए अच्छी तरह से आगे बढ़ने से पहले resuspended (यानी ऊपर और नीचे pipetting) की जरूरत है.
4 दिन
- ऊष्मायन के बाद, ताजा पौंड (उचित एंटीबायोटिक दवाओं युक्त) और acetosyringone (अंतिम एकाग्रता सुक्ष्ममापी 25) के साथ 10 एमएल के लिए कुल मात्रा में वृद्धि.
- एक और 16 घंटे के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर झटकों से प्रत्येक संस्कृति सेते हैं.
5 दिन
- अगले दिन हर संस्कृति दो बार धोने के कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 4000 XG में 10 (acetosyringone नहीं जोड़) मिलीलीटर (10 मिमी MgSO 4 0.7 एच 2 हे, 9 मिमी एमईएस, पीएच 5.6) घुसपैठ मध्यम और अपकेंद्रित्र जोड़कर.
- अंतिम centrifugation कदम के बाद, 5 मिलीलीटर घुसपैठ मध्यम युक्त acetosyringone (100 सुक्ष्ममापी) में प्रत्येक संस्कृति resuspend.
- आयुध डिपो 600nm उपाय, 0.1 और 0.9 के बीच माप स्वीकार्य हैं .
आयुध डिपो 600nm युक्ति: के रूप में 0.1 के रूप में कम के एक समस्या के बिना इस्तेमाल किया गया है, तथापि, उच्च ods अधिक अनुरूप परिणाम का उत्पादन हो सकता है. - अधिक 3 घंटे के लिए संस्कृतियों को सेते हैं करने के लिए संक्रमण के लिए Agrobacterium संस्कृतियों तैयार है.
- मिक्स संस्कृतियों (ओं) जीन विश्लेषण किया और संस्कृति के साथ एक 1:1 के अनुपात गस कैसेट युक्त नकारात्मक नियंत्रण (Agrobacterium खाली वेक्टर युक्त) से युक्त.
- घुसपैठ abaxial नए उभरते 1 मिलीलीटर सुई कम सिरिंज (1 छवि) का उपयोग पत्तियों के पक्ष (के तहत).
सुझाव: दोनों नकारात्मक नियंत्रण (खाली + वेक्टर गस कैसेट) मिश्रण और मिश्रण युक्त assayed हो ही संयंत्र के विपरीत पत्तों पर जीन (जीन एक्स + गस कैसेट) घुसपैठ. प्रत्येक उपचार के लिए तीन प्रतियों पौधों का उपयोग करें. - बाद घुसपैठ आबकारी 3 दिन गस प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए पत्तियां और परख में घुसपैठ की.
2. Histochemical गस परख
दिवस 8
- वैक्यूम excised पत्तियों में एक्स gluc सब्सट्रेट मध्यम घुसपैठ.
- कमरे रातोंरात तापमान पर या अलग नीले धुंधला दिखाई देता है जब तक अंधेरे में सेते हैं.
दिन 9
- Distillated पानी में कुल्ला.
- 70% इथेनॉल में सेते हैं जब तक क्लोरोफिल निकाल दिया जाता है, तो आसुत पानी के लिए फिर से हस्तांतरण. दिखने में गस अभिव्यक्ति के स्तर का आकलन करें.
3. Fluorometric मग परख:
दिवस 8
- तरल नाइट्रोजन का उपयोग करते हुए मोर्टार में घुसपैठ की पत्ती डिस्क पीस द्वारा कुल प्रोटीन को अलग. गस निष्कर्षण बफर के 100 उल (50 मिमी NaPi 7.0 पीएच, 10 मिमी EDTA, 0.1% Triton एक्स 100, 0.1% एन lauroylsarcosine सोडियम नमक, β-mercaptoethanol (0.7 μl / मिलीलीटर) जबकि बर्फ पर नमूना रखने. जोड़ें
- 14,000 जी पर निलंबन और 4 ° C से कम 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र कुल घुलनशील प्रोटीन के रूप में सतह पर तैरनेवाला ले.
- निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक nanodrop का उपयोग करके एकाग्रता उपाय.
- प्रत्येक गस निष्कर्षण बफर का उपयोग नमूने के लिए कुल घुलनशील प्रोटीन की 100 μg प्रोटीन एकाग्रता समायोजित करें.
- गस निष्कर्षण बफर में 2 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए तैयार मग (4-methylumbelliferyl बीटा डी glucuronide trihydrate) सब्सट्रेट जोड़ें. नमूना प्रति 100 μL (प्रोटीन + मग सब्सट्रेट) की कुल मात्रा के लिए पर्याप्त होना चाहिए.
- 37 पर 1 घंटे के लिए प्रतिक्रियाओं का सेते डिग्री सेल्सियस
- गस रोक बफर (0.2 एम ना 2 3 सीओ) के 800 μl जोड़कर प्रतिक्रियाओं बंद करो.
- 365 एनएम और 455 एनएम के उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य और एक म्यू मानक वक्र के लिए मानों की तुलना की एक उत्तेजना तरंगदैर्ध्य पर एक प्लेट रीडर का उपयोग कर प्रतिदीप्ति उपाय. गस गतिविधि के nmol / म्यू μg कुल घुलनशील प्रोटीन / मिनट के रूप में रिपोर्ट स्तरों.
4. स्टॉक्स और समाधान:
- Acetosyringone शेयर (1 एम) (परिवार कल्याण = 196.2 छ)
- (100 मिलीग्राम / एमएल) Kanamycin शेयर - DH में 0 2 तैयार - फिल्टर बाँझ
- (25 मिलीग्राम / एमएल) रिफैम्पिसिन शेयर - DMSO में तैयार
- Luria Bertani (पौंड) तरल विकास मीडिया: (1L)
1% (w / v) bacto - tryptone, 10 ग्राम
0.5% (w / v) निकालने bacto - खमीर, 5 ग्राम
170 मिमी सोडियम क्लोराइड 10 छ
पीएच - 7 - Acetosyringone (25 सुक्ष्ममापी) = 1 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा में 25 एम 1 शेयर की μl
- घुसपैठ मध्यम: (1L)
10 मिमी 4 0.7 DH 2 0 (परिवार कल्याण = 246.48 छ), 2.4648 ग्राम MgSO
9 मिमी एमईएस (परिवार कल्याण = 213.25 छ), 1.91925 जी
पीएच - 5.6 - (100 सुक्ष्ममापी) = 1 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा में 100 μl एक 1M शेयर की Acetosyringone
- गस एक्सट्रैक्शन बफर
50 मिमी NaPi 7.0 पीएच, 10 मिमी EDTA, 0.1% Triton एक्स-100, 0.1% एन lauroylsarcosine सोडियम नमक, β mercaptoethanol (0.7 μl / मिलीलीटर) - 2x फास्फेट बफर
0.2M नाह 4 पीओ और 0.2 एम ना HPO 2 4 7 पीएच 2 - एक्स - Gluc सब्सट्रेट समाधान
1 मिलीग्राम भंग 5 - ब्रोमो - 4 0.1 मिलीलीटर मेथनॉल में क्लोरोफ्लूरोकार्बन-3-indolyl BD-glucuronide (एक्स Gluc). 1 मिलीलीटर 2x फॉस्फेट बफर, 20 μl 0.1M ferricyanide पोटेशियम, 10μl Triton एक्स 100 10% और distillated पानी की 850 μl जोड़ें.
5. प्रतिनिधि परिणाम:
इस प्रोटोकॉल के बाद, गस अभिव्यक्ति के नुकसान की उम्मीद है जब कोशिका मृत्यु होती है. हम एक साथ रिपोर्टर जीन, cyto सुरक्षात्मक Arabidopsis बीसीएल-2 एसोसिएटेड athanoGene (बैग) परिवार के एक सदस्य के साथ β glucuronidase (गस) व्यक्त की है. हम सह घुसपैठ एन benthamiana 35S संचालित बैग अभिव्यक्ति कैसेट और गस वेक्टर pCAMBIA 2301 Agrobacterium तनाव LBA4404 का उपयोग के साथ छोड़ देता है. आंकड़ा 2 में दिखाया गया है, गस धुंधला में दिखाई वृद्धि इस घुसपैठ के बाद मनाया गया. इसके विपरीत, जब ज्ञात बीसीएल-2 परिवार के सदस्य समर्थक apoptotic BAX इस्तेमाल किया गया था, गस धुंधला के एक चिह्नित कमी (छवि 2) मनाया गया. इन मामलों की दोनों में, गस अभिव्यक्ति नियंत्रण की तुलना में दिख अलग था. हालांकि, जब अभिव्यक्ति में अंतर कम स्पष्ट है, fluorometric मग assays गस अभिव्यक्ति quanitate प्रदर्शन किया जा सकता है.
चित्रा 1. Agrobacterium एन के abaxial पक्ष के मिश्रण घुसपैठ का उदाहरण benthamiana 1 मिलीलीटर सिरिंज सुई कम का उपयोग कर छोड़ देता है.
चित्रा 2. एक गस वेक्टर सह एन में व्यक्त benthamiana विरोधी मौत, जीन और कोशिका मृत्यु का एक ज्ञात inducer के साथ छोड़ देता है. गस स्तर एक खाली वेक्टर नियंत्रण (गस नियंत्रण) की तुलना में थे.
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Discussion
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rifampicin | VWR international | IC19549001 | 25mg/mL stock in DMSO |
| 4’-hydroxy-3’,5’-dimethoxyacetophenone (Acetosyringone) | VWR international | TCD2666 | 0.981 g/mL in DMSO (1M stock) |
| 2-(4-morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate (MES) | VWR international | EM-6110 | 1.92 g/L in water for making 1 L of infiltration media |
| Bacto-tryptone | Fisher Scientific | BP1421-2 | 10g/L in water for making 1 L of LB medium |
| Bacto-yeast extract | VWR international | EM1.03753.0500 | 5g/L in water for making 1 L of LB medium |
| Sodium chloride | VWR international | EM-7710 | 10g/L in water for making 1 L of LB medium |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | VWR international | MK-7868-12 | 2.5g/L in water for making 50mM of buffer NaPi |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | VWR international | EMD-SX0715-1 | 5g/L in water for making 50mM of buffer NaPi |
| Magnesium sulfate heptahydrate | VWR international | EM-MX0070-1 | 2.5 g/L in water for making 1 L of infiltration media |
| N-Lauroylsarcosine | VWR international | TCL0151-500G | 0.1% v/v in GUS buffer |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronide cyclohexylammonium salt (X-gluc) | Gold Biotechnology | G1281C | 1mg/100uL in methanol 100% |
| 4-Methylumbelliferyl-μ-D-glucuronide hydrate (MUG) | Sigma-Aldrich | M5664 | 2 mM in 100 uL of GUS extraction buffer |
| Potassium ferrocyanide trihydrate | VWR international | EM-PX1460-1 | 100mM stock for X-gluc substrate solution |
| β-Methylumbelliferone(MU) | Sigma-Aldrich | M1381 | For MU standard curve use GUS extraction buffer |
| Sodium carbonate | VWR international | EM-SX0395-11 | 0.2 M in water for making GUS stop buffer |
References
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