Summary
일반적으로 이러한 DNA를 laddering 또는 TUNEL의 assays 같은 포유류의 시스템에서 사용되는 프로그램 세포 사망 assays은 종종 공장에서 재현하기가 어렵습니다. 귀스 기자 제도와 함께, 우리는 특정 유전자의 잠재적인 사형 속성을 분석하는 빠른, 식물 기반의 과도 분석을 제안합니다.
Abstract
우리는 동시에 세포 죽음의 putative 긍정적이거나 부정적인 규제와 리포터 유전자, β - glucuronidase (거스)를 표현하는 소설 과도 공장 표현 시스템을 개발했습니다. 이 시스템에서는, N. benthamiana의 잎은 분석하는 유전자를 포함하는 35S 구동 표현 카세트 공동 침투되며, 거스 벡터 pCAMBIA 2301은 차량으로 Agrobacterium 스트레인 LBA4404를 사용합니다. 거스 표현식이 발생하는 라이브 세포가 필요하기 때문에이 마커 유전자가 세포 죽음의 긍정적인 규제와 함께 공동으로 표현 때 거스 활동의 손실이 예상된다. 마찬가지로, 거스 활동 안티 apoptotic 유전자는 벡터 제어에 비해 사용하는 경우 관찰 증가했다. 아래 그림과 같이, 우리는 성공적으로 모두 프로와 안티 죽음 플레이어를 분석하기 위해 실험실에서이 시스템을 사용하고 있습니다. 이들은 같은 백스와 같은 세포 사망의 포유 동물 inducers 알려진 안티 - apoptotic 공장 BCL - 2 관련 athanoGene (BAG) 가족뿐만 아니라를 포함. 또한, 우리는이 단백질의 가능한 포스트 translational 수정 / 정품 인증에 대한 단서를 제공할 수 단백질 내의 특정 truncations의 죽음 기능을 분석하기 위해이 시스템을 사용하고 있습니다. 여기, 우리는 특정 유전자의 죽음 기능을 조사하는 초기 단계로, 신속하고 민감한 식물을 기반으로 방법을 제시한다.
Protocol
Nicotiana benthamiana 공장은 25 ° C에서 온도 제어 성장 챔버 재배하고 있습니다. 3~6주 오래된 식물의 완전 확장 건강한 단풍이 사용됩니다.
팁 : 더 나은 결과를 새로 신흥 잎을 사용하여 얻을 수 있습니다
1. Agrobacterium 과도 침투 프로토콜 :
1 일
- 세포 죽음에 대한 assayed하는 유전자 (들)과 포함하는 벡터로 적절한 벡터를 포함하는 Agrobacterium tumefaciens (변형 LBA4404)의 글리세롤 주식과 리크 LB / Rifampicin (25 μg / ML) / Kanamycin (100 μg / ML) 한천 플레이트 제정 발기인 아래 거스 카세트. 항상 부정적인 컨트롤로 빈 벡터 제어를 포함합니다.
- 28 ° C 2 일 품어.
3 일
- / Rifampicin / Kanamycin 판은 이전에 줄무늬 각 LB에서 하나의 식민지와 Rifampicin (25 μg / ML)과 Kanamycin (100 μg / ML)를 포함하는 LB 2 ML의 예방.
- 28 흔들어 ° C, 200 rpm으로 24 시간 최대 성장 밀도에 도달할 때까지 각 문화를 품다.
팁 : Clumping 때때로 경우 문화가 철저하게 진행하기 전에 (최대 pipetting 아래 IE) resuspended해야하는, 관찰됩니다.
일 사
- 부화 후, 신선한 LB (적절한 항생제를 포함) 및 acetosyringone (최종 농도 25 μm의) 10 ML에 전체 볼륨을 높일 수 있습니다.
- 또 다른 16 시간을위한 28 ° C에서 흔들어하여 각 문화를 품다.
5 일
- 다음날 실온에서 10 분 4,000 XG 10 ML (acetosyringone를 추가하지 마십시오) 침투 매체 (10 MM MgSO 4 0.7 H 2 O, 9 MM MES, 산도 5.6) 및 원심 분리기를 추가하여 두 번 각각의 문화를 씻으십시오.
- 최종 원심 분리 단계 후에, acetosyringone를 (100 μm의)이있는 5 ML의 침투 매체의 각 문화를 resuspend.
- OD 600nm를 측정, 0.1과 0.9 사이에 측정 가능합니다.
팁 : 0.1만큼 낮은의 OD 600nm가 문제없이 사용되었습니다 그러나, 높은 ODS 더 일관성있는 결과를 얻을 수 있습니다. - 감염 Agrobacterium 문화를 준비하는보다 3 시간에 대한 문화를 품다.
- 분석하는 유전자 (들)와 거스 카세트를 포함하는 문화와 1:1 비율에서 대조군 (Agrobacterium은 빈 벡터를 포함)를 포함하는 혼합 문화.
- 1 ML 바늘 적은 주사기를 (그림 1)를 사용 새로 신흥 나뭇잎의 abaxial (아래) 측면을 침투.
팁 : 부정적인 제어 혼합 (빈 벡터 + 거스 카세트)와 같은 식물의 잎 반대에 assayed되도록 유전자를 (유전자 X + 거스 카세트)이있는 혼합물을 모두 침투. 각 치료 세중의 공장을 사용합니다. - 포스트 침투 소비세 3 일 거스 단백질 표현 나뭇잎과 분석에 침투.
2. Histochemical 거스 분석
일 6.25
- excised 나뭇잎에 X - gluc 기판 매체에 침투 진공.
- 하룻밤 상온이나 뚜렷한 파란색 얼룩이 나타날 때까지 어둠 속에 품어.
주 9
- distillated 물에 씻어.
- 엽록소가 제거 될 때까지 다시 증류수로 전송 후, 70 % 에탄올에 품어. 시각 거스 표현 수준을 평가.
3. Fluorometric 얼굴 분석 :
일 6.25
- 액체 질소를 사용하여 절구에 침투 잎 디스크를 연마하여 전체 단백질을 분리. 거스 추출 버퍼 100 UL (50 MM NaPi 산도 7.0, 10 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 0.1 % 트리톤 X - 100, 0.1 % N - lauroylsarcosine 나트륨 소금, β - 메르 캅 토 에탄올 (0.7 μl / ML) 얼음에 샘플을 유지하면서. 추가
- 4 ° C에서 5 분 1만4천그램에 현탁액을 원심과 총 가용성 단백질로 뜨는 가져가라.
- 제조 업체의 지침에 따라 nanodrop를 사용하여 농도를 측정.
- 거스 추출 버퍼를 사용하여 각 샘플에 대한 전체 가용성 단백질의 100 μg에 단백질 농도를 조정합니다.
- 2 mm의 최종 농도 거스 추출 버퍼 준비 얼굴 기판 (4 methylumbelliferyl - β - D - glucuronide trihydrate)를 추가합니다. 샘플 당 100 μL (단백질 + 얼굴 기판)의 총 볼륨은 충분해야합니다.
- 37 1 시간에 대한 반응을 품어 ° C.
- 거스 중지 버퍼 (0.2 M 나 2 CO 3) 800 μl를 추가하여 반응을 중지합니다.
- 365 NM 및 방출 파장 455 nm의의와 MU 표준 곡선에 값을 비교의 여기 파장에서 플레이트 판독기를 사용하여 형광을 측정합니다. nmol의 MU / μg 총 단백질 / 분 가용성으로 거스 활동의보고 수준.
4. 주식 및 솔루션 :
- Acetosyringone (1 M) 주식 (FW = 196.2 g)
- Kanamycin (100 MG / ML) 재고가 - DH 2 0 준비 - 필터 소독
- Rifampicin (25 MG / ML) 주식 - DMSO의 준비
- Luria - Bertani (LB) 액체 성장 미디어 (1L)
1% (W / V) bacto - tryptone, 10g
0.5 % (W / V) bacto - 효모 추출물, 5g
170 MM의 나트륨 염화물 10g
산도 - 7 - Acetosyringone (25 μm의) 1 ML의 최종 볼륨에 1 M의 주식 = 25 μl
- 침투 매체 : (1L)
10 MM MgSO 4 0.7 DH 2 0 (FW = 246.48 g), 2.4648 g
9 밀리 MES (FW = 213.25 g), 1.91925 g
산도 - 5.6 - Acetosyringone (100 μm의) 1 ML의 최종 볼륨 1M 주식 = 100 μl
- 거스 추출 버퍼
50 MM NaPi 산도 7.0, 10 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 0.1 % 트리톤 X - 100, 0.1 % N - lauroylsarcosine 나트륨 소금, β - 메르 캅 토 에탄올 (0.7 μl / ML) - 2X 인산 버퍼
0.2M 아니 2 PO 4 0.2 M 나 2 HPO 4 산도 7 - X - Gluc 기판 솔루션
1 MG를 해산 5 브로모 -4 - 클로로 - 3 - 인돌릴 0.1 ML의 메탄올에 BD - glucuronide (X - Gluc). 1 ML 2X 인산 버퍼, ferricyanide 20 μl 0.1M의 칼륨, 10μl 트리톤 X - 100 10 % distillated 물을 850 μl를 추가합니다.
5. 대표 결과 :
세포 사망이 발생하면이 프로토콜에 따라, 거스 표현의 손실이 예상된다. 우리는 동시에 cyto - 보호 Arabidopsis BCL - 2 관련 athanoGene (BAG) 가족의 일원과 β - glucuronidase 리포터 유전자 (거스)을 표현했습니다. 우리는 공동 침투 N. benthamiana는 Agrobacterium 스트레인 LBA4404를 사용하여 35S 구동 가방 표현 카세트와 거스 벡터 pCAMBIA 2301로 떠납니다. 그림 2에 표시된 거스 얼룩에 눈에 띄는 증가는이 침투 다음과 같은 관찰되었다. 반대로, BCL - 2 가족의 알려진 프로 apoptotic 회원 백스가 사용되었을 때, 거스 얼룩의 표시 감소는 (그림 2) 관찰되었다. 이러한 경우 모두에서, 거스 표현식은 컨트롤에 비해 가시 달랐다. 그러나, 표현의 차이가 덜 분명하면 fluorometric 얼굴 assays은 거스 표현 quanitate을 수행할 수 있습니다.
그림 1. N.의 abaxial 측면의 Agrobacterium 혼합물의 침투의 예 benthamiana는 1 ML 바늘 적은 주사기를 사용하여 떠납니다.
그림 2. 거스 벡터는 N. 공동 표현했습니다 benthamiana는 안티 - 죽음의 유전자 및 세포 사망의 알려진 유도로 떠납니다. 거스 수준은 빈 벡터 제어 (거스 제어)에 비해했다.
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Discussion
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rifampicin | VWR international | IC19549001 | 25mg/mL stock in DMSO |
| 4’-hydroxy-3’,5’-dimethoxyacetophenone (Acetosyringone) | VWR international | TCD2666 | 0.981 g/mL in DMSO (1M stock) |
| 2-(4-morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate (MES) | VWR international | EM-6110 | 1.92 g/L in water for making 1 L of infiltration media |
| Bacto-tryptone | Fisher Scientific | BP1421-2 | 10g/L in water for making 1 L of LB medium |
| Bacto-yeast extract | VWR international | EM1.03753.0500 | 5g/L in water for making 1 L of LB medium |
| Sodium chloride | VWR international | EM-7710 | 10g/L in water for making 1 L of LB medium |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | VWR international | MK-7868-12 | 2.5g/L in water for making 50mM of buffer NaPi |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | VWR international | EMD-SX0715-1 | 5g/L in water for making 50mM of buffer NaPi |
| Magnesium sulfate heptahydrate | VWR international | EM-MX0070-1 | 2.5 g/L in water for making 1 L of infiltration media |
| N-Lauroylsarcosine | VWR international | TCL0151-500G | 0.1% v/v in GUS buffer |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronide cyclohexylammonium salt (X-gluc) | Gold Biotechnology | G1281C | 1mg/100uL in methanol 100% |
| 4-Methylumbelliferyl-μ-D-glucuronide hydrate (MUG) | Sigma-Aldrich | M5664 | 2 mM in 100 uL of GUS extraction buffer |
| Potassium ferrocyanide trihydrate | VWR international | EM-PX1460-1 | 100mM stock for X-gluc substrate solution |
| β-Methylumbelliferone(MU) | Sigma-Aldrich | M1381 | For MU standard curve use GUS extraction buffer |
| Sodium carbonate | VWR international | EM-SX0395-11 | 0.2 M in water for making GUS stop buffer |
References
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