Summary
ampliPHOX колориметрических технологии обнаружения представлена как недорогая альтернатива флуоресценции обнаружения микрочипов. На основе фотополимеризации, ampliPHOX производит твердые пятна полимера видна невооруженным глазом в течение нескольких минут. Результаты затем отображаемого и автоматически интерпретировать с простой, но мощный пакет программного обеспечения.
Protocol
1. Примеры усиления использованием RT-PCR
- Выделите вирусную РНК из клинического материала или вирусной изолировать использованием вирусов Qiagen MinElute Спиновые Kit в сочетании с автоматизированной QIAcube нуклеиновые кислоты платформы добычи. Экстракция выполняется на 200 мкл образца с конечного объема элюции 60 мкл. Магазин экстрактов при -70 ° С или ниже для дальнейшего использования.
- В шаблоне свободной области, подготовить RT-PCR Master Mix на льду в соответствии с протоколом производителя. Чтобы включить биотина в течение RT-PCR, используйте смесь биотинилированного дНТФ вместо производителя поставляются дНТФ смеси. Стоимость использования биотинилированного смесь дНТФ меньше, чем $ 1 USD / анализа. Альтернативные методы биотин включения, такие как использование биотинилированного грунтовка также может быть использован. Добавить грунтовки смеси при конечных концентрациях 1,0 мкМ для гриппа, 1,0 мкМ для гриппа В, и 0,14 мкМ для внутреннего контроля. Грипп грунтовки набор усиливает сегмент матрицу гена (1032 п продукт) и гриппа B набор грунтовка усиливает неструктурных генов сегмента (811 нт продукта). Каждый набор содержит FluChip грунтовки одного праймера с 5 'фосфорильной группы для облегчения поколения одноцепочечной ДНК с помощью ферментативного расщепления с лямбда экзонуклеазная следующих ПЦР. В результате одноцепочечной продукт требует гораздо меньше времени, чем гибридизации двухцепочечную эквивалента и значительно сокращает общее время анализа. Предварительно приготовленной смеси из этих праймеров, а также внутреннюю РНК шаблон управления доступны из InDevR заинтересованных научных работников на ограниченной основе.
- Кратко вихря и распределять 18 мкл мастер смеси в тонкостенных труб ПЦР.
- Передача трубок на лед, чтобы подходящее место работы для того шаблона, и добавьте 2 мкл шаблон для каждой реакции трубки.
- Передача пробирки для ПЦР в термоциклер, и выполните следующие тепловые Профиль обратной транскрипции при 50 ° С в течение 30 мин, инактивации фермента / активации при температуре 95 ° С в течение 15 мин, 40 циклов ПЦР составляет 95 ° С в течение 30 с, 55 ° С в течение 30-х и 72 ° С в течение 1 мин, а окончательное расширение при 72 ° С в течение 10 мин.
2. Гибридизация ПЦР-продукты с низкой плотностью микрочипы
- В целях получения одноцепочечной ДНК для FluChip гибридизации, готовят смесь ферментативного пищеварения, комбинируя 1,0 мкл фермента экзонуклеазная лямбда, 2,2 мкл буфера сопровождающих реакцию, и 0,8 мкл нуклеазы без воды. Эти суммы для одного образца, но может быть просто масштабируется для общего количества проб, чтобы быть переварены. Удалить образцы термоциклер и добавьте 4 мкл приготовленной смеси для каждой реакции переварить фосфорилированных прядь продукта ПЦР. Вернуться образцы термоциклер и программы термоциклер до 37 градусов по Цельсию в течение 15 минут, затем на 95 градусов по Цельсию в течение 10 минут для завершения ферментативного пищеварения и шаги тепла фрагментации.
- Пользовательских микрочипов гриппа использоваться печатаются на альдегид функционализированных слайды стекла прикладной Microarrays Inc (Темпе, штат Аризона). 5'-амино прекращено последовательности захвата в сочетании с оптимизированной кровянистые выделения буфера и напечатаны в конечной концентрации 20 мкМ (за исключением прямой последовательности управления, которая дополнительно имеет 3'-биотин модификации и выставляется в конечной концентрации 500 нМ) . Бесконтактного кровянистые выделения метод, с оптимальным диаметром пятна 300 мкм и от центра до центра шагом 700 мкм.
- Удалить из микрочипов ящик для хранения и применения одноразовых скважин гибридизации вокруг микрочипов, удалив защитный лист и нажимая твердо вокруг хорошо периметру.
- Место слайдов мыть бен содержащих 110 мл очищенной воды на 5 минут предварительно гибридизации смойте орбитальный шейкер на 60-90 оборотов в минуту. Сухой массив, слегка касаясь ткани стеклоочистителя на край колодца и позволяет воде быть злой прочь.
- Комбинат 22 мкл 2х буфера гибридизации с каждым из фрагментированных продуктов оцДНК и пипеткой 40 мкл гибридизации решений в микрочипов скважин.
- Разрешить слайды к гибридизации в закрытой камере влажности в течение 60 минут.
- Удалить слайды из камере влажности, кратко ополосните массивов с промывочного буфера D в ополосните бутылку прежде чем положить в слайд стойку. Обычно промывку объем промывочного буфера D составляет 2 мл на массив. Место слайд стойку содержащих слайды в мытье бен содержащих 110 мл промывочного буфера А. Место бен на орбитальном шейкере при 60-90 оборотов в минуту в течение 1 минуты.
- Удалить слайд стойки из промывочного буфера, кратко промыть промывочного буфера D, передача слайд стойку, чтобы бен содержащие B промывочный буфер, и пожать на 60-90 оборотов в минуту в течение 5 минут.
- Аккуратно сухой массив на каждом слайде, и место сушеные слайдов в камере влажности при подготовке шаги ampliPHOX колориметрический Detection.
3. ampliPHOX: маркировка гибридизированных и калибровку продукции чипов с ampliTAG
- Объединять 10 мкл ampliTAG, 20 мкл 2х буфера ampliTAG и 10 мкл очищенной воды для каждого массива, подлежащих обработке. Реагент объемы могут быть просто масштабируется для общего количества проб. Убедитесь в том, чтобы подготовить достаточно смеси маркировки для учета всех образцов массивы массивов и калибровки необходимо. Число калибровочных чипов необходимо зависит от того, вы выполняете полную калибровку (для нового документа или новой партии реагентов), или просто инструмент проверки. Для полной калибровки, 3 фишки калибровки, должны быть маркированы, и для реагента проверить, только один чип калибровки, должны быть маркированы. Пожалуйста, обратите внимание, что до калибровки массивы помечены, они должны пройти через предварительно гибридизации стиральной шаг, который ранее был описан для гриппа массивов.
- Передача 40 мкл этикетке смеси каждого массива и позволяют маркировки протекания реакции в закрытой камере влажности в течение 5 минут.
- Немедленно промойте массивов с промывочного буфера D в ополосните бутылку до размещения слайдов в слайд стойку. Трансфер в стойку бен содержащих 110 мл промывочного буфера C, и пожать на 60-90 оборотов в минуту в течение 5 минут.
- Использование второго бен мыть с водой очищенной, выполнить три последовательных кратких провалы водой, чтобы удалить соль остатка. Сухой массивов, слегка касаясь ткани стеклоочистителя к краю скважин.
- Микрочипы теперь правильно помечены ampliTAG, а остальная часть процедуры обнаружения ampliPHOX может быть выполнена. Фотоактивация и обработки изображений меченых массивы должны быть завершены в течение 24 часов, а также дополнительные массивы могут быть сохранены в темном поле слайда до использования.
4. ampliPHOX: калибровка, усиления сигнала и изображения
- Включите ampliPHOX читателя и обеспечить ampliVIEW программное обеспечение готово к фотоактивации.
- Определить оптимальное время фотоактивации использованием калибровочных чипов. В дополнение к кратким введением, которое следует, эта процедура также подробно описан в ручном режиме ampliPHOX. Калибровки чипы содержат ряд разведений биотинилированного последовательного управления, которые используются для оптимизации чувствительности анализа, с целью максимизации числа строк калибровки чипа, которые производят положительный сигнал, как определено программного обеспечения.
- Удалить ampliPHY от 4 ° C, позволяют нагреться до комнатной температуры, и вихрь коротко перемешать. Внесите 3 мкл ampliPHY усилитель в ampliPHY флаконе, и вихревые тщательно в течение 10 секунд.
- Равномерно передачи 40 мкл раствора в ampliPHY микрочипов и содержащие ampliTAG меченных массив, гарантирующий, что ни пузырьков присутствуют. Закройте флакон ampliPHY между каждым приложением. Вставьте слайд микрочипов в фотоактивации бухте чтения ampliPHOX.
- Для первого массива калибровку, использовать время по умолчанию фотоактивации в 'Time' окно на панели левой программного обеспечения, и нажмите кнопку "Пуск" зеленую кнопку, чтобы начать фотоактивации. После завершения удаления массива и промыть очищенную воду, чтобы удалить лишнюю ampliPHY. Открытый образования полимера на некоторых из пятна теперь должна быть доступна.
- Разрешить полимера пятна высохнуть в течение 2 минут, затем распространить две капли ampliRED на массив и позволить окрашивание проводили в течение 2 минут.
- Затем, быстро промыть микрочипов с очищенной водой и насухо протрите тканью.
- Вставьте микрочипов в визуализации бухте ampliPHOX Reader, и нажмите кнопку «New Image Capture" в закладке изображений. После отображаемого, настроить обрезать и сохранить изображение.
- В Анализ вкладки, выберите маску калибровки Чип и кнопку "Auto размещения", чтобы начать анализ. Программное обеспечение будет автоматически производить "Краткий отчет 'показывает количественные результаты. Основываясь на этих результатах, фотоактивации время корректируется на 10 секунд для второго массива калибровки, и процедура повторяется.
- Как только оптимальное время фотоактивации был определен, образец массивы могут быть обработаны с использованием тех же усиление сигнала и изображения протокол, используемый для калибровки массивов.
- После съемки изображения для выборки массивов, маски для вашего конкретного расположения массива, такие как расположение гриппа массива описаны здесь, могут быть created.The ampliVIEW программное обеспечение способно выполнять автоматизированный анализ изображений и генерации гриппа подтипов результаты для каждого образца.
5. Представитель Результаты:
Рисунок 1. Схематическое изображение метода обнаружения ampliPHOX колориметрических. (А) Биотинилированные ДНК цель гибридизации с каждой точки в массиве, и (Б) помечены ampliTAG. (C) ampliPHY раствор затем добавил, и (D) под действием света в форме видимых пятен полимера. (Е) полимера пятна образуются впоследствии окрашиваются нетоксичных красителей для улучшения контрастности.
Рисунок 2. () Грипп низкой плотности расположения микрочипов. Последовательности 1-7 и 10-13 целевым грипп, и последовательностей 8, 9 целевой гриппа B. (В) ampliPHOX и (С) флуоресцентные изображения 2009 гриппа H1N1 («свиной грипп») образца показывает той же схеме обнаружения и методы.
Рисунок 3. Слева направо, представитель изображений ampliPHOX гриппа H3N2, человека происхождения H1N1, 2009 гриппа H1N1 (свиного происхождения), а отрицательные образца. Все три подтипа показать визуально различимых узоров на массив. Обратите внимание на отрицательное, что только MS2 внутреннего контроля видно, что указывает на РТ-ПЦР-амплификации не была запрещена.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Обнаружение ampliPHOX колориметрических технология, представленная здесь, быстрый, недорогой альтернативой один цвет флуоресценции обнаружения для нижних приложений плотность микрочипов. Схематически показано на рисунке 1, принцип обнаружения основан на использовании фотоинициатора этикетке (1Б). В присутствии мономера раствор, содержащий (1С), освещенность причины фотоинициатора (ampliTAG), чтобы вызвать реакцию полимеризации только в маркированных регионов (1D). Хотя продемонстрировали здесь, на ДНК-массив для идентификации гриппа и подтипов, технология может быть расширена, чтобы обнаружить любые биотинилированного продукт, снятые на микрочипов. В качестве примера, наши предыдущие работы по фотополимеризации обнаружение, основанное на использовании различного химического реагента был продемонстрирован по обе нуклеиновые кислоты и на основе антител массивов. 12 Другие также показали, доказательство концепции для антител и белков-приложений из фотополимеризации-системы . В этих случаях, различных химических реагентов требуется продувкой инертным газом были использованы. 13,14
Схема гриппа низкой плотности микрочипов и представитель изображения можно увидеть на рисунке 2. Показанный на рис 2А, массив содержит пространственные маркер / подзорные контроля (в красном) и 14 уникальных последовательностей захвата (в синем), каждый замечены в трех экземплярах. Захват последовательности аминокислот с завершающим синтетических коротких (~ 25 MER) олигонуклеотидов предназначена для захвата цели гриппа, генетически представитель конкретных типов или подтипов гриппа. Захват последовательности предназначены для производства совершенно разных моделей на чипе для различных гриппа подтипов. Цифры 2В и 2С показывают прямое сравнение обнаружения 2009 гриппа H1N1 образца по ampliPHOX и традиционных флуоресценции соответственно. Флуоресценции результате, создан с помощью конфокальной флуоресцентной микрочипов сканер (Genetix aQuire). Же общая картина обнаружения можно легко видеть, для обоих методов, однако, результат ampliPHOX видна невооруженным глазом.
Показанный на рисунке 3, ampliPHOX результаты трех представитель гриппа положительных образцов и одного отрицательного образца, обработанным протокол, описанный здесь. Цифры 3A, 3B, 3C и результаты показывают, для человеческого происхождения H3N2, человеческого происхождения H1N1, и свиного происхождения H1N1 (2009 роман H1N1), соответственно. Четкое различие в общей структуре обнаружения легко видеть по этим 3 изображения. Например, можно видеть, что последовательности 2 и 3 производят сигнал для всех подтипов гриппа, показали (3А-3С), но, что последовательности 10, 12 и 13 только производят сигналом для свиного происхождения H1N1 образца (3C) . Этот подход был использован ранее успешно типа и подтипа вирусов гриппа на микрочипов. 6,8,10 Важно отметить, что отрицательное образца показано на рисунке 3D показывает сигнал на внутреннюю последовательность контроля, что указывает на отсутствие торможения или провал RT-PCR реакции.
Интерпретация этих изображений легко автоматизировать с помощью программного обеспечения ampliVIEW. Сначала пользователь использует программное обеспечение, чтобы определить микрочипов макета, а затем описать, какие цели должны быть представлены для получения определенного "ответ" на этот макет. Например, грипп расположение показано на рисунке 2А может генерировать логические результаты, такие как "грипп положительные", "гриппа B положительные", "без сезонного гриппа", "сезонный грипп", и "отрицательные", в зависимости от желаемых результатов. Как только эти логические задания выполнены и сохранены, программное обеспечение может автоматически интерпретировать образы обеспечить результат с небольшим пользовательского ввода.
ampliPHOX технологии обнаружения создает визуальные, колориметрические результаты меньшую плотность микрочипов с аналогичной чувствительностью к флуоресценции в считанные минуты. Мы считаем, что сочетание простых в использовании, недорогие реагенты с недорогой прибор обеспечивает привлекательную альтернативу для традиционных методов обнаружения микрочипов, особенно в более целенаправленный характер, низкую плотность геномной / диагностических микрочипов стали все чаще используются в различных приложениях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все авторы являются сотрудниками InDevR, Inc, некоммерческая организация. InDevR является коммерциализация технологии ampliPHOX, описанных здесь.
Acknowledgments
InDevR признает NIH / NIAID U01AI070276 и R43AI077112 для финансирования этой работы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Qiagen MinElute Virus Spin Kit | Qiagen | 57704 | single 60 μl elution |
| QIAcube | Qiagen | 9001292 | optional |
| ABI 9800 Fast Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4441166 | |
| Qiagen OneStep RT-PCR kit | Qiagen | 210210 | kit dNTPs not used |
| 2x Spotting Buffer | InDevR Inc. | MI-5007 | |
| Biotinylated dNTP Mix | InDevR Inc. | MI-5009 | |
| Lambda exonuclease | Epicentre Biotechnologies | LE032K | 2500 U, 10U/μl |
| FluChip primer mix | InDevR Inc. | N/A | not yet available for sale |
| Orbital Shaker | Madell Technology | ZD-9556-A | |
| Wash Bins | InDevR Inc. | MI-4002 | |
| Wash Racks | InDevR Inc. | MI-4003 | |
| 2x Hybridization Buffer | InDevR Inc. | MI-5004 | |
| Calibration Chips | InDevR Inc. | AP-5006 | |
| Wash Buffers A-D | InDevR Inc. | MI-5005 | |
| ampliRED | InDevR Inc. | AP-5004 | |
| ampliTAG | InDevR Inc. | AP-5001 | |
| 2x ampliTAG Buffer | InDevR Inc. | AP-5002 | |
| ampliPHY, ampliPHY enhancer | InDevR Inc. | AP-5003 |
References
- Kumar, R. M. The Widely Used Diagnostics "DNA-Microarray"-A Review. Amer J Inf Dis. 5, 207-218 (2009).
- Miller, M. B., Tang, Y. W. Basic Concepts of Microarrays and Potential Applications in Clinical Microbiology. Clin Microbiol Rev. 22, 611-633 (2009).
- Mikhailovich, V., Gryadunov, D., Kolchinsky, A., Makarov, A. A., Zasedatelev, A. DNA microarrays in the clinic: infectious diseases. BioEssays. 30, 673-682 (2008).
- Call, D. R. Challenges and opportunities for pathogen detection using DNA microarrays. Crit Rev Microbiol. 31, 91-99 (2005).
- Raoult, D., Fournier, P. E., Drancourt, M. What does the future hold for clinical microbiology. Nat Rev Microbiol. 2, 151-159 (2004).
- Dawson, E. D., Rowlen, K. L. MChip: A Single Gene Diagnostic for Influenza A. Influenza: Molecular Virology. Wang, Q., Tao, Y. J. , Caister Academic Press. Norfolk, UK. (2010).
- Gall, A., Hoffman, B., Harder, T., Grund, C., Ehricht, R., Beer, M. Rapid hemagglutinin subtyping and pathotyping of avian influenza viruses by a DNA microarray. J Virol Meth. 160, 200-205 (2009).
- Townsend, M. B., Dawson, E. D., Mehlmann, M., Smagala, J. A., Dankbar, D. M., Moore, C. L., Smith, C. B., Cox, N. J. FluChip: Experimental evaluation of a diagnostic influenza microarray. J Clin Microbiol. 44, 2863-2871 (2006).
- Wang, Z., Daum, L. T., Vora, G. J., Metzgar, D., Walter, E. A., Canas, L. C., Malanosky, A. P., Lin, B., Stenger, D. A. Identifying influenza viruses with resequencing arrays. Emerg Inf Dis. 12, 638-646 (2006).
- Kessler, N., Ferraris, O., Palmer, K., Marsh, W., Steel, A. Use of the DNA Flow-Thru Chip, a three-dimensional biochip, for typing and subtyping of influenza viruses. J Clin Microbiol. 42, 2173-2185 (2004).
- Kuck, L. R., Taylor, A. W. Photopolymerization as an innovative detection technique for low-density microarrays. Biotechniques. 45, 179-186 (2008).
- Avens, H. J., Bowman, C. N. Development of fluorescent polymerization-based signal amplification for sensitive and non-enzymatic biodetection in antibody arrays. Acta Biomat. 6, 83-89 (2010).
- Sikes, H. D., Jenison, R., Bowman, C. N. Antigen detection using polymerization-based amplification. Lab on a Chip. 9, 653-656 (2008).
