Summary
ampliPHOX colorimetrische detectie technologie wordt gepresenteerd als een goedkoop alternatief voor fluorescentie detectie voor microarrays. Op basis van fotopolymerisatie, ampliPHOX produceert vaste polymeer vlekken die zichtbaar zijn met het blote oog in slechts een paar minuten. Resultaten worden vervolgens afgebeeld en automatisch geïnterpreteerd met een eenvoudige maar krachtige software pakket.
Abstract
DNA microarrays hebben zich ontwikkeld tot een krachtig hulpmiddel voor het opsporen van ziekteverwekkers. 1-5 bijvoorbeeld, vele voorbeelden van het vermogen om te type en subtype influenza virus zijn aangetoond. 6-11 De identificatie en subtypering van influenza op DNA microarrays heeft toepassingen in zowel de publieke gezondheid en de kliniek voor vroege opsporing, snelle interventie, en het minimaliseren van de impact van een grieppandemie. Traditionele fluorescentie is momenteel de meest gebruikte micro-array detectie methode. Echter, zoals microarray technologie voortschrijdt naar klinisch gebruik, een te vervangen dure instrumenten met een lage cost detectie technologie vertonen vergelijkbare prestaties kenmerken fluorescentie zal microarray testen aantrekkelijker en kosten-effectief is.
De ampliPHOX colorimetrische detectie technologie is bestemd voor onderzoek-toepassingen en heeft een detectiegrens binnen een orde van grootte van de traditionele fluorescentie 11, met een groot voordeel dat een ongeveer tien maal lager instrument kosten in vergelijking met de confocale microarray scanners die nodig zijn voor fluorescentie microarray detectie. Een ander voordeel is de compacte afmetingen van het instrument die het mogelijk maakt voor draagbaarheid en flexibiliteit, in tegenstelling tot traditionele fluorescentie-instrumenten. Omdat de polymerisatie-technologie is niet zo lineair als inherent fluorescentie detectie, echter, is het meest geschikt voor een lagere dichtheid microarray toepassingen waarbij een ja / nee antwoord op de aanwezigheid van een bepaalde volgorde gewenst is, zoals voor het opsporen van ziekteverwekkers arrays. Momenteel is de maximale dichtheid plek compatibel is met ampliPHOX detectie is ~ 1800 plekken / array. Omwille van de plek dichtheid van beperkingen, hogere dichtheid microarrays zijn niet geschikt voor ampliPHOX detectie.
Hier presenteren wij ampliPHOX colorimetrische detectie technologie als een methode van signaalversterking op een lage dichtheid microarray ontwikkeld voor de detectie en karakterisering van influenza virussen (FluChip). Hoewel dit protocol maakt gebruik van het FluChip (een DNA microarray) als een specifieke toepassing van ampliPHOX detectie, een microarray te nemen gebiotinyleerd doel kan worden geëtiketteerd en ontdekt in een vergelijkbare manier. De microarray ontwerp en biotinylatie van het doel vast te leggen onder de verantwoordelijkheid van de gebruiker. Zodra de gebiotinyleerde doelstelling is vastgelegd op de array, kan ampliPHOX detectie worden uitgevoerd door eerst het coderen van de array met een streptavidine-label conjugaat (ampliTAG). Bij blootstelling aan licht met behulp van de ampliPHOX Reader instrument, polymerisatie van een monomeer oplossing (ampliPHY) komt alleen voor in gebieden met ampliTAG-gelabeld doelen. De gevormde polymeer kan vervolgens worden gekleurd met een niet-giftige oplossing voor visueel contrast te verbeteren, gevolgd door beeldvorming en analyse met behulp van een eenvoudige software-pakket (ampliVIEW). De gehele FluChip test van de VN-geëxtraheerde monster resultaat kan worden uitgevoerd in ongeveer 6 uur, en de ampliPHOX detectie hierboven beschreven stappen kunnen worden ingevuld in ongeveer 30 minuten.
Protocol
1. Voorbeeld amplificatie met behulp van RT-PCR
- Extract viraal RNA uit klinisch materiaal of een viral te isoleren met behulp van de Qiagen MinElute Virus Spin Kit in combinatie met de QIAcube geautomatiseerde nucleïnezuur-extractie platform. Extracties worden uitgevoerd op 200 ul exemplaar met een laatste elutie volume van 60 ui. Bewaar extracten bij -70 ° C of lager voor later gebruik.
- In een sjabloon free-gebied, de voorbereiding van de RT-PCR Master Mix op ijs volgens protocol van de fabrikant. Op te nemen biotine tijdens de RT-PCR, gebruik dan een gebiotinyleerd dNTP mengsel in plaats van de fabrikant geleverde dNTP mix. De kosten van het gebruik van een gebiotinyleerde dNTP mengsel is minder dan $ 1 USD / test. Alternatieve methoden van biotine opname, zoals het gebruik van een primer gebiotinyleerd kan ook worden gebruikt. Voeg primer mixen op eindconcentraties van 1,0 uM voor Griep A, 1,0 uM voor griep B en 0,14 uM voor de interne controle. De Griep A primerset versterkt de matrix-gen segment (1032 nt product) en de B-griep primerset versterkt een niet-structurele gen segment (811 nt product). Elke FluChip primer set bevat een primer met een 5 'fosforyl groep tot de generatie van enkelstrengs DNA via enzymatische vertering met lambda exonuclease volgende PCR te vergemakkelijken. Het resulterende enkelstrengs product vergt veel kortere hybridisatie keer dan de dubbel-strengs gelijkwaardig zijn en aanzienlijk verkort de totale test tijd. Een pre-bereid mengsel van deze primers, alsook de interne controle RNA template zijn beschikbaar van InDevR aan geïnteresseerde onderzoekers op een beperkte basis.
- Kort vortex en distribueren van 18 ul van de master mix in dunwandige PCR-buizen.
- Transfer buizen op ijs om een geschikte werkplek voor template Bovendien, en voeg 2 pl sjabloon om elke reactie buis.
- Overdracht PCR-buizen naar een thermal cycler, en voer de volgende thermische profiel: reverse transcriptie bij 50 ° C gedurende 30 min, enzym inactivatie / activering bij 95 ° C gedurende 15 min, 40 PCR-cycli van 95 ° C gedurende 30 s, 55 ° C voor 30s en 72 ° C gedurende 1 minuut, en een laatste verlenging bij 72 ° C gedurende 10 minuten.
2. Hybridisatie van RT-PCR-producten aan lage dichtheid microarrays
- Met het oog op enkelstrengs DNA hybridisatie voor FluChip genereren, de voorbereiding van de enzymatische vertering mengsel door het combineren van 1,0 ul lambda exonuclease enzym, 2,2 ul van de bijbehorende reactie buffer, en 0,8 pi nuclease-vrij water. Deze bedragen zijn voor een monster, maar kan eenvoudig worden geschaald voor het totale aantal monsters te worden verteerd. Verwijder monsters van de thermal cycler en voeg 4 pi van het mengsel bereid om elke reactie op de gefosforyleerde onderdeel van het PCR-product te verteren. Keer terug monsters aan de thermal cycler en het programma van de thermal cycler tot 37 graden Celsius gedurende 15 minuten gevolgd door 95 graden Celsius gedurende 10 minuten tot enzymatische vertering en warmte fragmentatie stappen uit te voeren.
- De aangepaste gebruikte griep microarrays worden afgedrukt op aldehyde gefunctionaliseerde glasplaatjes door Applied Microarrays Inc (Tempe, AZ). 5'-amino beëindigd capture sequenties worden gecombineerd met een geoptimaliseerde spotten buffer en afdrukken bij een uiteindelijke concentratie van 20 uM (behalve voor de positieve controle-sequentie die bovendien beschikt over een 3'-biotine modificatie en is gespot bij een uiteindelijke concentratie van 500 nM) . Een non-contact spotting methode wordt gebruikt, met een optimale plek diameter van 300 urn en centrum tot centrum toonhoogte van 700 micrometer.
- Verwijder microarrays van de opslag doos en toe te passen voor eenmalig gebruik hybridisatie bronnen in de buurt van de microarrays door het verwijderen van het beschermende vel en druk stevig rond goed perimeter.
- Plaats de glaasjes in een wasbeurt bak die 110 ml gezuiverd water voor een 5 minuten pre-hybridisatie wassen met een orbitale schudder op 60-90 rpm. Droog de array door zachtjes aanraken van een tissue ruitenwisser aan de rand van de put en waardoor water weg te slecht.
- Combineer 22 pi 2x hybridisatiebuffer met elk van de gefragmenteerde ssDNA producten en pipet 40 ul van de hybridisatie-oplossingen in de microarray putten.
- Laat dia's in een gesloten vochtkamer hybridiseren gedurende 60 minuten.
- Verwijder de dia's van de vochtigheid kamer, kort afspoelen arrays met Wash Buffer D in een fles spoelen alvorens in de dia rack. Typisch de spoelen volume van Wash Buffer D is 2 ml per array. Plaats slide rek met dia's in te wassen bin die 110 ml wasbuffer A. Plaats bin on rondschudapparaat op 60-90 rpm gedurende 1 minuut.
- Verwijder slide rek uit Wash Buffer A, even afspoelen met Wash Buffer D, transfer schuift rack een bak met Wash Buffer B, en schud op 60-90 rpm gedurende 5 minuten.
- Voorzichtig droog de array op elke dia, en plaats gedroogde dia's in de luchtvochtigheid kamer in voorbereiding op ampliPHOX Colorimetrische Detection stappen.
3. ampliPHOX: etikettering gehybridiseerd product en calibratie chips met ampliTAG
- Combineren 10 ul van ampliTAG, 20 ul van 2x ampliTAG buffer, en 10 ul van gezuiverd water voor elk aanbod te verwerken. Reagens volumes kan eenvoudig worden geschaald voor het totale aantal monsters. Zorg ervoor dat u voldoende etikettering mengsel te bereiden om rekening te houden voor alle sample arrays en kalibratie arrays nodig. Het aantal benodigde kalibratie chips hangt af van of je bent het uitvoeren van een volledige kalibratie (voor een nieuw instrument of nieuwe hoop van de reagentia), of gewoon een instrument te controleren. Voor een volledige kalibratie, moet 3 calibratie chips worden geëtiketteerd, en voor een reagens controle, slechts een kalibratie-chip moeten worden geëtiketteerd. Houdt u er rekening mee dat voor de kalibratie arrays zijn gemarkeerd, moeten ze gaan door de pre-hybridisatie wasstap die eerder werd beschreven voor de influenza arrays.
- Overdracht 40 pi van het label mengsel aan elke reeks en laat labelreactie in een gesloten kamer luchtvochtigheid gedurende 5 minuten.
- Spoel arrays met Wash Buffer D in een fles spoelen alvorens dia's in een slide rek. Overdracht rek in de bak die 110 ml Wash Buffer C, en schud op 60-90 rpm gedurende 5 minuten.
- Met behulp van een seconde was bak gevuld met gezuiverd water, voer dan drie opeenvolgende korte dips water om zout te verwijderen. Droog de arrays door zachtjes aanraken van een tissue ruitenwisser aan de rand van de putten.
- De microarrays worden nu correct gelabeld met ampliTAG, en de rest van de ampliPHOX detectie-procedure kan worden uitgevoerd. Fotoactivatie en beeldvorming van het label arrays dient te worden ingevuld binnen de 24 uur, en extra arrays kunnen worden opgeslagen in een donkere glijbaan doos tot gebruik.
4. ampliPHOX: ijking, signaalversterking, en imaging
- Zet ampliPHOX reader op en zorgen voor ampliVIEW software is klaar voor fotoactivatie.
- Bepaal de optimale fotoactivatie tijd met kalibratie chips. In aanvulling op de korte introductie die volgt, is deze procedure ook in detail beschreven in de ampliPHOX Operation Manual. De kalibratie chips bevatten een reeks van verdunningen van een gebiotinyleerd controle volgorde die worden gebruikt om de gevoeligheid van de assay te optimaliseren, met als doel het maximaliseren van het aantal rijen van de kalibratie chip die een positief signaal, zoals bepaald door de software te produceren.
- Verwijder ampliPHY van 4 ° C, laat op te warmen tot kamertemperatuur, en vortex kort te mengen. Pipetteer 3 pi van ampliPHY enhancer in de ampliPHY flacon, en vortex goed voor 10 seconden.
- Gelijkmatig overdracht 40 ul van ampliPHY oplossing in de microarray goed met de ampliTAG-label array, ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen aanwezig zijn. Sluit het ampliPHY flacon tussen elke toepassing. Steek de microarray dia in de fotoactivatie baai van de ampliPHOX Reader.
- Voor de eerste kalibratie array gebruik maken van de standaard fotoactivatie tijd in de 'Tijd' vakje op de linker paneel van de software, en klik op de groene 'Start' knop om het fotoactivatie te starten. Eenmaal voltooid, verwijder de array en afspoelen met gezuiverd water om overtollig ampliPHY te verwijderen. Duidelijke polymeer formatie op een aantal van de vlekken moet nu zichtbaar zijn.
- Laat het polymeer plekken om te drogen gedurende 2 minuten, daarna verdelen twee druppels van ampliRED op de array en laat vlekken om door te gaan gedurende 2 minuten.
- Vervolgens snel microarray afspoelen met gezuiverd water en droog met een tissue schoon te vegen.
- Plaats microarray in de beeldvorming baai van de ampliPHOX Reader en klik op de 'Capture New Image' knop in de Imaging tabblad. Een keer afgebeeld, aan te passen het gewas en het beeld opslaan.
- In de Analyse tab, selecteer de Kalibratie Chip masker en de 'Auto Placement' knop om de analyse te starten. De software zal automatisch een 'Summary Record ", waarop de gekwantificeerde resultaten. Op basis van deze resultaten, is het fotoactivatie tijd aangepast door 10 seconden voor de tweede kalibratie array, en wordt de procedure herhaald.
- Zodra de optimale fotoactivatie tijd is vastgesteld, kan het monster arrays worden verwerkt met behulp van dezelfde signaalversterking en imaging protocol dat wordt gebruikt voor de kalibratie arrays.
- Zodra het beeld wordt vastgelegd voor het monster arrays, kan een masker voor uw specifieke reeks lay-out, zoals de griep reeks lay-out hier beschreven worden created.The ampliVIEW software is in staat om geautomatiseerde beeldanalyse en het genereren van influenza subtypering resultaten voor elk monster.
5. Representatieve resultaten:
Figuur 1. Schematische weergave van de ampliPHOX colorimetrische detectie methode. (A) Biotinylated doel-DNA wordt gehybridiseerd aan elke plek in de array, en (B) gelabeld met ampliTAG. (C) ampliPHY oplossing wordt dan toegevoegd, en (D) zijn blootgesteld aan licht tot zichtbare plekken polymeer vormen. (E) De gevormde polymeer plekken worden vervolgens gekleurd met een niet-giftige kleurstof om het contrast te verbeteren.
Figuur 2. (A) Influenza lage dichtheid microarray lay-out. Sequences 1-7 en 10-13 doelgroep influenza A, en sequenties 8, 9 doelwit influenza B. (B) ampliPHOX en (C) fluorescentie beelden van een 2009 nieuwe H1N1 ('varkensgriep') specimen met dezelfde detectie patroon door zowel methoden.
Figuur 3. Van links naar rechts, representatief ampliPHOX beelden voor influenza A H3N2, menselijke oorsprong H1N1, 2009 nieuwe H1N1 (varkensgriep-oorsprong), en een negatief exemplaar. Alle drie subtypes tonen visueel duidelijke patronen op de array. Merk op dat in het negatieve dat alleen de MS2 interne controle wordt gezien, was met vermelding van de RT-PCR-amplificatie niet geremd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De ampliPHOX colorimetrische detectie technologie hier wordt gepresenteerd is een snel, goedkoop alternatief voor een kleur fluorescentie detectie voor een lagere dichtheid microarray-toepassingen. Schematisch weergegeven in figuur 1, is de detectie principe gebaseerd op het gebruik van een foto-initiator label (1B). In de aanwezigheid van een monomeer-bevattende oplossing (1C), blootstelling aan licht zorgt ervoor dat de foto-initiator (ampliTAG) op gang te brengen een polymerisatiereactie alleen in het label regio's (1D). Hoewel het hier gedemonstreerd op een DNA array voor influenza identificatie en subtypering, kan de technologie worden uitgebreid tot alle gebiotinyleerde product gevangen op een microarray te detecteren. Als een voorbeeld, was ons eerder werk op fotopolymerisatie-gebaseerde detectie met een ander reagens chemie aangetoond op zowel de nucleïnezuur en antilichaam-gebaseerde arrays. 12 Anderen hebben ook de proof of concept voor antilichamen en eiwitten gebaseerde applicaties van een fotopolymerisatie-systeem op basis van getoonde . In deze gevallen, werden verschillende reagens chemische samenstellingen die spoelen met een inert gas gebruikt. 13,14
Een schema van de influenza lage dichtheid microarray en representatieve beelden is te zien in figuur 2. Getoond in Figuur 2A, de array bevat een ruimtelijk marker / spotting controle (in rood) en 14 unieke sequenties vast te leggen (in blauw), elk gespot in drievoud. De vangst sequenties zijn amino-beëindigd synthetische kort (~ 25 mer) oligonucleotiden ontworpen om influenza doelen die genetisch representatief zijn voor specifieke soorten of subtypen van influenza vast te leggen. De vangst sequenties zijn ontworpen om duidelijk verschillende patronen te produceren op de chip voor de verschillende influenza A subtypen. Figuren 2B en 2C tonen een directe vergelijking van de detectie van een 2009 nieuwe H1N1-proefstuk door ampliPHOX en traditionele fluorescentie, respectievelijk. De fluorescentie resultaat was gegenereerd met behulp van een confocale fluorescentie microarray scanner (Genetix aQuire). Dezelfde totale detectiepatroon kan gemakkelijk worden gezien voor beide methoden, maar de ampliPHOX resultaat is zichtbaar voor het blote oog.
Weergegeven in figuur 3 zijn ampliPHOX de resultaten van drie representatieve influenza A positieve specimens en een negatief monster als verwerkt door het protocol hier beschreven. Figuren 3A, 3B, 3C en showresultaten voor een menselijke oorsprong H3N2, menselijke oorsprong H1N1, en varkens-H1N1 herkomst (2009 roman H1N1), respectievelijk. Een duidelijk verschil in de totale detectie patroon kan gemakkelijk worden gezien voor deze 3 beelden. Zo is te zien dat de reeksen 2 en 3 te produceren signaal voor alle van het influenza A subtypen getoond (3A-3C), maar dat sequenties 10, 12 en 13 alleen het signaal te produceren voor de varkens-H1N1 oorsprong monster (3C) . Deze benadering is eerder gebruikt om met succes type en subtype influenza virussen op een microarray. 6,8,10 Belangrijk is dat het negatieve model in figuur 3D-signaal op de interne controle sequentie toont, aangeeft dat er geen remming of falen van de RT-PCR-reactie.
De interpretatie van deze beelden is eenvoudig geautomatiseerd door de ampliVIEW software. De gebruiker maakt gebruik van eerst de software het bepalen van de microarray lay-out, en dan te beschrijven welke doelstellingen moeten aanwezig zijn om een bepaalde "antwoord" voor deze lay-out te genereren. Kan bijvoorbeeld de influenza lay-out getoond in Figuur 2A te genereren logische resultaten zoals "Griep A positief", "griep B positief", "niet-seizoensgebonden influenza A", "seizoensgebonden influenza A", en "negatieve", afhankelijk van de gewenste resultaten. Zodra deze logische opdrachten zijn gemaakt en opgeslagen, kan de software automatisch de interpretatie van de beelden naar een resultaat met weinig invoer van de gebruiker te bieden.
ampliPHOX detectie technologie genereert visuele, colorimetrische resultaten voor een lagere dichtheid van microarrays met vergelijkbare gevoeligheid voor fluorescentie in minuten. Wij geloven dat de combinatie van makkelijk te gebruiken, goedkope reagentia met een low-cost instrument biedt een aantrekkelijk alternatief voor de traditionele microarray detectiemethoden, met name meer gerichte, een lagere dichtheid genomische / diagnostische microarrays steeds meer gebruikt in een verscheidenheid aan toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alle auteurs zijn werknemers van InDevR, Inc, een for-profit entiteit. InDevR is het commercialiseren van de ampliPHOX technologie hierin beschreven.
Acknowledgments
InDevR erkent NIH / NIAID U01AI070276 en R43AI077112 voor de financiering van dit werk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Qiagen MinElute Virus Spin Kit | Qiagen | 57704 | single 60 μl elution |
| QIAcube | Qiagen | 9001292 | optional |
| ABI 9800 Fast Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4441166 | |
| Qiagen OneStep RT-PCR kit | Qiagen | 210210 | kit dNTPs not used |
| 2x Spotting Buffer | InDevR Inc. | MI-5007 | |
| Biotinylated dNTP Mix | InDevR Inc. | MI-5009 | |
| Lambda exonuclease | Epicentre Biotechnologies | LE032K | 2500 U, 10U/μl |
| FluChip primer mix | InDevR Inc. | N/A | not yet available for sale |
| Orbital Shaker | Madell Technology | ZD-9556-A | |
| Wash Bins | InDevR Inc. | MI-4002 | |
| Wash Racks | InDevR Inc. | MI-4003 | |
| 2x Hybridization Buffer | InDevR Inc. | MI-5004 | |
| Calibration Chips | InDevR Inc. | AP-5006 | |
| Wash Buffers A-D | InDevR Inc. | MI-5005 | |
| ampliRED | InDevR Inc. | AP-5004 | |
| ampliTAG | InDevR Inc. | AP-5001 | |
| 2x ampliTAG Buffer | InDevR Inc. | AP-5002 | |
| ampliPHY, ampliPHY enhancer | InDevR Inc. | AP-5003 |
References
- Kumar, R. M. The Widely Used Diagnostics "DNA-Microarray"-A Review. Amer J Inf Dis. 5, 207-218 (2009).
- Miller, M. B., Tang, Y. W. Basic Concepts of Microarrays and Potential Applications in Clinical Microbiology. Clin Microbiol Rev. 22, 611-633 (2009).
- Mikhailovich, V., Gryadunov, D., Kolchinsky, A., Makarov, A. A., Zasedatelev, A. DNA microarrays in the clinic: infectious diseases. BioEssays. 30, 673-682 (2008).
- Call, D. R. Challenges and opportunities for pathogen detection using DNA microarrays. Crit Rev Microbiol. 31, 91-99 (2005).
- Raoult, D., Fournier, P. E., Drancourt, M. What does the future hold for clinical microbiology. Nat Rev Microbiol. 2, 151-159 (2004).
- Dawson, E. D., Rowlen, K. L. MChip: A Single Gene Diagnostic for Influenza A. Influenza: Molecular Virology. Wang, Q., Tao, Y. J. , Caister Academic Press. Norfolk, UK. (2010).
- Gall, A., Hoffman, B., Harder, T., Grund, C., Ehricht, R., Beer, M. Rapid hemagglutinin subtyping and pathotyping of avian influenza viruses by a DNA microarray. J Virol Meth. 160, 200-205 (2009).
- Townsend, M. B., Dawson, E. D., Mehlmann, M., Smagala, J. A., Dankbar, D. M., Moore, C. L., Smith, C. B., Cox, N. J. FluChip: Experimental evaluation of a diagnostic influenza microarray. J Clin Microbiol. 44, 2863-2871 (2006).
- Wang, Z., Daum, L. T., Vora, G. J., Metzgar, D., Walter, E. A., Canas, L. C., Malanosky, A. P., Lin, B., Stenger, D. A. Identifying influenza viruses with resequencing arrays. Emerg Inf Dis. 12, 638-646 (2006).
- Kessler, N., Ferraris, O., Palmer, K., Marsh, W., Steel, A. Use of the DNA Flow-Thru Chip, a three-dimensional biochip, for typing and subtyping of influenza viruses. J Clin Microbiol. 42, 2173-2185 (2004).
- Kuck, L. R., Taylor, A. W. Photopolymerization as an innovative detection technique for low-density microarrays. Biotechniques. 45, 179-186 (2008).
- Avens, H. J., Bowman, C. N. Development of fluorescent polymerization-based signal amplification for sensitive and non-enzymatic biodetection in antibody arrays. Acta Biomat. 6, 83-89 (2010).
- Sikes, H. D., Jenison, R., Bowman, C. N. Antigen detection using polymerization-based amplification. Lab on a Chip. 9, 653-656 (2008).
