Summary
死亡的细胞被挤压协调一致的收缩邻近的细胞，上皮组织，而不破坏的屏障功能。发展中国家斑马鱼的光学清晰度提供了一个极好的系统，以可视化挤出生活上皮。在这里，我们描述的方法来诱导和幼虫斑马鱼的表皮细胞决议形象挤压。
Abstract
稳态维持上皮组织需要不断清除而不破坏的屏障功能受损的细胞。我们的研究发现，死亡的细胞信号传递给他们住邻居的形式和合同的肌动蛋白和肌球蛋白环弹出上皮表，而关闭任何可能导致其退出的差距，这个过程被称为细胞挤出1。发展中国家斑马鱼的光学清晰度提供了一个极好的系统，以可视化挤出生活上皮。在这里，我们描述了一种方法来诱导和幼虫斑马鱼表皮的形象挤出。可视化挤出，注射F -肌动蛋白红色荧光蛋白标记的探针进入细胞阶段在表皮表达绿色荧光蛋白的转基因斑马鱼的胚胎和诱导凋亡的G418除了幼虫。然后，我们使用一个旋转的光盘共聚焦显微镜成像技术观察在细胞凋亡挤出过程中的肌动蛋白动力学和上皮细胞行为的时间推移。这种方法使我们能够调查上皮细胞在活的挤压过程中，将提供一个途径研究由故障消除细胞凋亡引起的疾病状态。
Protocol
在发展中国家斑马鱼的表皮细胞挤压在肌动蛋白动力学的可视化的基本工作流程
发展中国家斑马鱼的表皮是由两个不同的层，面层（或周皮）和基底层的细胞接触基底膜 2 。外表面层的细胞发生凋亡，并从组织消除挤出 3（图1） 。为了实时可视化这个过程中，我们注入的RNA编码红色荧光蛋白融合成单细胞阶段的转基因表达绿色荧光蛋白（GFP斑马鱼utrophin，肌动蛋白结合蛋白（RFP - UtrCH）4,5，调宁蛋白同源结构域）根据分层的上皮细胞启动子细胞角蛋白8月6 日（图2A） 。虽然在后的RNA注射的动物表达RFP - UtrCH是无处不在，我们集中表达RFP和GFP遵循的表皮（图2B）中的肌动蛋白动力学专上肤浅的表皮细胞。然后，我们把与G418幼虫诱导细胞凋亡的挤压和图像使用一个旋转盘共聚焦显微镜的表皮和微丝，并获得4D数据集。
实验开始之前
- 使用mMessage mMachine SP6试剂盒（Ambion公司）从一个线性DNA模板体外转录RNA和净化使用的RNeasy试剂盒（QIAGEN）的上限核糖核酸。使用无菌水稀释的RNA〜60ng/ul，直到注射35μL分装并储存于-80 ° C。注意：避免重复冻结/解冻，以防止RNA的降解。
- 制作模具在E3胚胎培养基（E3）的2％琼脂糖40ML浇筑100 × 15mm的培养板，此托盘放置在一个显微注射模具（自适应科学工具，＃I - 34）期间举行注射胚胎。一旦琼脂糖凝固后，取出模具，暴露在琼脂糖槽。储存在4 ° C，直到准备使用该板块。
- 拉细丝（0.78外径1.0MM，编号，10公分长）和一个萨特的P - 97在以下设置（485，热拉50，速度60，延时/ 90，压力200移液器拖轮使用注射硼硅玻璃毛细管针）。注：不同类型的玻璃，将规定的上市条件的优化。
- 1％低熔点（LM）的琼脂糖在E3和存储毫升分装在42 ° C。要小心，因为从股票的E3蒸发可以增加琼脂糖浓度。
- 保持标准的实验室条件下的成年斑马鱼，一个普通的光/暗周期14小时光照和10小时黑暗的 7 。前一天晚上的实验设置分频器分离坦克3名女性和2名男性，鱼交配。第二天早晨，改变水箱中的水和拉分压器，当灯光来。
1。注射荧光标记的肌动蛋白结合蛋白编码RNA的
- 在冰上解冻的RNA。 〜30ng/μl最终的RNA浓度为1:1的比例加入0.5％酚红的RNA装入一把拉住毛细管针回填加入1μl的解决方案。
- 收集〜75 1 - 8细胞阶段CK：在E3 GFP的胚胎。吸管收集5胚胎的显微注射模具¾巴斯德吸管轻轻东方在与福斯特杜蒙＃5镊子的低谷胚胎。注意：小心迅速开展工作，以避免注射到多细胞阶段的胚胎，这可能会导致镶嵌注入的RNA表达。
- 一个标准的实验室解剖立体显微镜下，使用压力控制微量（哈佛大学器械的PLI - 100的Pico -注射器）胚胎的卵黄注入的RNA。红点（酚红）应该在胚胎注射后可见。每个实验注入至少50个胚胎。 （见以前的Jove协议一个详细的RNA注射到斑马鱼的胚胎9协议）。注意：
- 〜2nl卷应使用的RNA注射到细胞阶段的胚胎。要确定注入的RNA的量，分配到校准微米幻灯片上的矿物油下降或比例尺内置目镜显微镜下的RNA丸。 RNA的液滴应该是一个完美的球体。计算所使用的方程交付量：卷（NL）=4/3πr3。调整通过改变喷油压力或时间上的仪器的交付量。
- 也应采取注入RNA的最低数额，允许可视化的荧光，高浓度的RNA可以到发育中的胚胎有毒。要确定适当的表达水平，实验剂量曲线应进行运行实验之前</ LI>
- 胚胎进行排序，以消除任何未受精或损坏的鸡蛋和地方所有剩余的胚胎在28.5 ° C。
- 24小时后，使用荧光解剖显微镜选择，有一个高水平的绿色荧光蛋白（表皮）和RFP（肌动蛋白）荧光的斑马鱼胚胎。放置在选定的胚胎28.5 ° C，直到准备进行诱导细胞凋亡的药物治疗。
2。在使用G418的斑马鱼幼虫诱导细胞挤出
我们已经发现，暴露的氨基糖甙类抗生素G418的，或Geneticin，导致由一个未知的机制在发展中国家斑马鱼幼虫3的表皮细胞凋亡和挤压。更重要的是，这种治疗方法只幼虫，后4天施肥和老年人。我们发现，可以发现在任何给定的G418治疗幼虫斑马鱼的鳍上皮的时间挤出〜5-25细胞。由于挤出凋亡细胞的数量可能有所不同从鱼到渔，我们建议安装多种鱼类成像。
- 收集和地点4天的受精后（DPF）35 x 10mm的文化包含3毫升的E3（MLS）的菜都将参展GFP和RFP荧光的斑马鱼幼虫。可以治疗25幼虫在这种规模的培养皿。
- 仔细取代含有1mg/ml的G418和孵化幼虫在药物4小时的E3 3mLs媒体在28.5 ° C需要注意的是G418的对光敏感，所以要小心，保持覆盖的培养皿或在黑暗中。
- 删除媒体和预热28.5 ° C E3的媒体含有0.02％Tricaine的更换，并进行安装的幼虫。
3。安装成像斑马鱼幼虫
- 3幼虫转移到1.5 mL Eppendorf管和后取出鱼沉到试管底部的E3。我们发现，3动物可以正确安装的琼脂糖凝固之前。
- 在盖玻片上一个MatTek培养皿的底部使用一个吸管尖切进管，吸管1％LM -琼脂糖（42℃）120ul，混匀，然后轻轻吸管幼虫和琼脂糖混合物。
- 使用插入针或钨针，快速定位的幼虫，所以他们对MatTek盘的玻璃罩平直，一个FST的针座。
注：我们通常使用直针第一东方幼虫，然后一个L形的针，以确保他们对玻璃罩持平，而防止损坏的标本。 - 一旦琼脂糖凝固后，轻轻地填写E3含0.02％Tricaine的菜。注：另外，G418可以添加到成像盘继续诱导挤压E3，虽然长期暴露1mg/ml的G418的杀幼虫。
4。住在细胞挤出肌动蛋白动力学和个人的上皮细胞行为的成像，使用一个旋转的光盘共聚焦显微镜
我们发现，从发展的斑马鱼幼虫的表皮细胞凋亡挤出的整个过程大约需要20分钟3。在这里，我们将演示如何设置一个时间推移的成像实验，收集通过对斑马鱼表皮的单层一系列z平面可视化挤出过程。我们发现，造成重大典型的宽视场荧光显微镜的光漂白微丝和不允许timelapse成像。因此，最大限度地发挥我们的决议，并防止漂白，我们使用一个旋转盘共聚焦显微镜。下面我们介绍如何设置使用安道尔IQ软件与尼康显微镜的实验，虽然讨论的原则可以应用到类似显微镜调校。
- 首先，打开氩（488nm GFP的激发）和氦氖（RFP的激发561nm）激光器，显微镜，照相机和啶灯。
- 在安道尔IQ软件（版本1.10.1），创建时间的一系列协议，其中包含你想要的波长图像，图像捕获和次数之间的间隔的频率应重复捕捉。
- 轻轻将MatTek菜含有您的标本，在显微镜舞台上，并使用透射光20倍的目标，把重点放在幼虫。
- 移动到正确位置的40倍的水浸泡目标（NA 0.8）。使用这个目标，我们可以拍摄约20％至25场，这让我们跟随在挤出过程中的细胞行为的同时，也解决了亚细胞的肌动蛋白动力学细胞。注意：相同的安装和成像策略可应用于直立显微镜，虽然40倍的水浸泡长工作距离的目标，必须使用。
- 小心地40X目标上方的水下降，并迅速MatTek菜放在上面。不E：蔡司Immersol浸泡的解决方案也可用于水的蒸发是一个问题。
- 确定使用阶段或DIC照明的标本，然后用488nm epifluorescence专门专注于GFP阳性表皮。
- 切换到共焦扫描模式。调节激光的强度和曝光时间，为每个通道（488nm和561nm）作相应。照顾，平衡信号的最佳检测激光功率和曝光时间，并防止任何漂白或毒性。
- 要确定挤出细胞，使用epifluorescence的可视化的绿色荧光蛋白标记的表皮和识别的细胞组中的一个经典的花环图案，中间一个小圆形细胞周围的细胞集合组成。使用共焦扫描模式，也应该有一个积累RFP标记的肌动蛋白作为一个环在中间，周围的小圆形细胞的细胞挤出的一个标志可见。一旦你已经确定了一个挤出细胞，迅速成立显微镜获取4D共聚焦数据集（XYZ时间）。
- 设置在z平面的上部和下部的点看到一个单层表皮，包括挤出细胞，然后选择步长的大小。对于时间推移成像，图像采集和重复次数的时间间隔。例如，我们通常会获得一个Z系列横跨5 - 10微米，1微米的步长，每隔1-2分钟，30分钟。
- 要查看数据，我们通常使Z系列的3 - D的预测，并保存为影片文件是兼容快速时间（苹果）设置的数据。在这种方式下，我们可以可视化的肌动蛋白环，随着时间的推移而死亡细胞周围发生的上皮行为的收缩。
5。代表性的成果
图1。细胞凋亡挤出示意图。微丝显示为红色，GFP阳性表皮细胞都是绿色的。
图2。实验工作流程。 A.实验的工作流程示意图， B。 RFP - UtrCH表达一个4dpf长江：绿色荧光斑马鱼的表皮。
图3。帧从一个时间推移电影，活肌动蛋白动力学在上皮细胞挤出 的过程如下（Z -预测） 。箭头表示超过2分钟的过程中，合同和关闭邻近的细胞所形成的肌动蛋白环。
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Discussion
这里所描述的协议演示了一个简单而直接的方法来可视化挤压过程，在现场的上皮组织。这种类型的实验使我们以前没有固定组织分析赞赏的肌动蛋白动力学研究中的细微之处，因此，常见的免疫方法的补充。我们可以利用这个协议在组合化学抑制剂或基因突变体，以便更好地分析删除和清除细胞凋亡，我们期望与故障相关的挤压过程和研究疾病状态下会导致炎症反应或受损细胞的积累，为见于癌症。例如，我们实验室先前已表明，化学抑制剂可与G418的组合来改变针对微丝沿基底的细胞表面，从而影响方向的一个细胞挤出 3 。当前方法的限制之一是，由于随机和不可预知性细胞死亡的，我们的数据集往往把重点放在后期的挤压。要研究的多细胞的肌动蛋白环的形成并开始收缩，将适用于未来的实验技术在上皮细胞的基因有针对性的细胞死亡10荧光标记的一个子集凋亡诱导。我们形象肌动蛋白在表皮的动态的方法相结合，这一战略应促进对导致细胞凋亡挤出的早期步骤的研究。总之，从这些实验中获得的信息将显着增加上皮细胞挤压和医疗意义的认识。
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Disclosures
动物福利保障
在此使用的斑马鱼， 斑马鱼的协议执行的所有程序，已批准的机构动物护理和使用委员会（IACUC）在美国犹他州大学（动物福利保证＃10-07017） 。
Acknowledgments
罗森布拉特实验室的科学讨论，建议和意见，我们感谢成员。我们还要感谢玛丽哈洛伦请提供质粒RFP - UtrCH和大卫格伦沃尔德提供的CK：GFP转基因斑马鱼。还要感谢格蕾琴国王和良好的维护和斑马鱼的护理工作人员在犹他州立大学的集中斑马鱼资源。这项工作是由美国国立卫生研究院NIGMS美国国立卫生研究院主任的新的创新奖1 DP2 OD002056 - 01至JR支持。 GTE公司是由美国国立卫生研究院癌症多学科培训项目资助5T32 CA03247 - 8的支持。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| RNeasy Mini Kit | Reagent | Qiagen | 74104 | |
| mMessage mMachine SP6 Kit | Reagent | Ambion | AM1340 | |
| Crossing Tanks | Tool | Thoren Aquatic Systems | ||
| The Pipet Pump | Tool | Bel Art Products | F3789 | |
| 5 ¾ Pasteur Pipet | Tool | VWR international | 14672-608 | |
| Microinjection Mold | Tool | Adaptive Science Tools | I-34 | |
| 100x15mm Culture Plate | Tool | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Flamming/Brown Micropipet Puller | Tool | Sutter Instrument Co. | Model P97 | |
| Borosilicate Glass Capillaries with Filament | Tool | Sutter Instrument Co. | B1400-78-10 | OD 1.0mm, ID 0.78mm, 10cm length |
| Electrode Storage Jar | Tool | World Precision Instruments, Inc. | E210 | |
| Phenol Red | Reagent | Sigma-Aldrich | P0290 | 0.5% in DPBS |
| Pressure-Controlled Microinjector and Micromanipulator | Tool | Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| 35x10mm Culture Dish | Tool | Cellstar | 627-160 | |
| G418 (Geneticin) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10131-035 | 50 mg/mL in dH20 |
| Dumont #5 Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| 12cm Pin Holder | Tool | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Insert Pins | Tool | Fine Science Tools | 26007-02 and-03 | |
| Glass Bottom Culture Dish with 1.5 coverglass | Tool | MatTek Corp. | P35G-1.5-10-C | |
| Low Melt Agarose | Reagent | Fisher Scientific | BP1360-100 | |
| Tricaine | Reagent | Sigma-Aldrich | A-5040 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Leica Microsystems | MZ6 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Nikon Instruments | SMZ645 | |
| Fluorescent Dissecting Microscope | Microscope | Olympus Corporation | S2X12 | |
| Spinning Disc Confocal Microscope | Microscope | Nikon Instruments | Eclipse Ti | Outfitted with a Yokagawa spinning disc head |
| CCD Camera | Camera | Andor | DV-885-VP | 1002x1004x8 micron square pixels |
References
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