Silicon Microchips voor het manipuleren van Cel-cel interactie

Summary

Dit artikel beschrijft een experimentele benadering voor de dynamische regeling van cel-cel interacties tussen adherente cellen op een micrometer schaal. Manipulatie van intercellulaire communicatie tussen de hepatocyten en stromale cellen is aangetoond. De ontwikkelde platform maakt het onderzoek van cel-cel interacties in een verscheidenheid van biologische processen, waaronder de ontwikkeling en de pathogenese.

Abstract

De rol van de cellulaire micro-omgeving wordt erkend als cruciaal bij het bepalen lot van de cel en functie in vrijwel alle weefsels van zoogdieren van ontwikkeling tot maligne transformatie. In het bijzonder, is de interactie met de naburige stroma in verband gebracht met een overvloed van biologische verschijnselen, maar conventionele technieken beperken de mogelijkheid om de ruimtelijke en dynamische elementen van dergelijke interacties te ondervragen.

In Micromechanische Herconfigureerbare Cultuur (RC), gebruiken we een micromachined silicium substraat met bewegende delen om dynamisch cel-cel interacties controle door middel van mechanische herpositionering. Eerder, is deze methode toegepast op intercellulaire communicatie te onderzoeken in co-culturen van hepatocyten en niet-parenchymcellen, waaruit blijkt de tijd-afhankelijke interacties en een beperkt bereik voor oplosbare signalering ^1.

Hier beschrijven we in detail de bereiding en het gebruik van de RC-systeem. We beginnen met het aantonen van de behandeling kan het apparaat delen met een pincet, waaronder bedienen van tussen de kloof en contact configuraties (celpopulaties gescheiden door een smalle 80-um gap, of in direct intiem contact). Vervolgens gaan we detail het proces van voorbereiding van de substraten voor cultuur, en de multi-step cell seeding proces die nodig zijn voor het verkrijgen van samenvloeiende cel monolagen. Met behulp van live-microscopie, we vervolgens illustreren real-time manipulatie van cellen tussen de verschillende mogelijke experimentele configuraties. Tenslotte tonen we de stappen die nodig zijn om het apparaat oppervlak voor hergebruik regenereren: tolueen en piranha's schoonmaken, polystyreen coating, en zuurstof plasma behandeling.

Protocol

Voorbereiding van de celculturen:

1. Begin met siliconen delen bedekt met plasma behandeld polystyreen.
2. Coat delen met de juiste extracellulaire matrix eiwitten aan de bevestiging van de gewenste celtype te ondersteunen. Voor de hepatocyten, incuberen in 50 g / ml collageen-1-oplossing bij 37 ° C gedurende 45 minuten. Voor 3T3 fibroblasten, is er geen matrix nodig is.
3. Delen van sloten met complementaire delen die in contact configuratie.
4. Soak in 70% ethanol voor een minimum van 10 minuten te steriliseren. Spoel 2x in DDH ₂ O, en 1x in celcultuur media.
5. Zaad-cellen bij een concentratie van 500.000 cellen / ml in de juiste kweekmedium. Gebruik 1 ml in elke well van een 12-well plaat cultuur.
6. Incubeer gedurende 1 uur, schudden elke 15 minuten opnieuw te schorten cellen gelijkmatig.
7. Als een confluente monolaag niet is bereikt na een uur, zuigen de celsuspensie en herhaal zaaien met een frisse schorsing. Herhaal dit totdat de gewenste cel dichtheid is bereikt.
8. Verwijder de complementaire onderdelen. Overdracht onderdelen in de frisse putten en incubeer overnacht, zodat cellen om zich te houden en te verspreiden volledig.
9. Vormen co-culturen door het blokkeren van de desbetreffende gedeelten in een van beide de spleet of neem contact op configuratie. De configuratie kan worden gewijzigd op elk gewenst moment tijdens cultuur.
10. Bij het wijzigen van media, zorg aan cellen drogen verlaten voor zo weinig mogelijk tijd, bij voorkeur net een seconde of twee. Haal vloeistof met een hand en onmiddellijk te vervangen media met de andere hand.

De verwerking van silicium onderdelen voor hergebruik:

1. Strip-cellen door het weken in bleekwater en spoelen met water.
2. Laat onderdelen volledig drogen. Laten weken in tolueen gedurende 2 uur tot polystyreen strip.
3. Clean in piranha-oplossing (1:02 H ₂ O _2: H ₂ SO ₄₎ verwarmd tot 120 ° C.
4. Spoel gedurende 15 min onder een continue stroom van DDH ₂ O. Als u niet van plan om meteen storten polystyreen, bewaar de onderdelen in het water.
5. Los polystyreen in tolueen bij 100 mg / ml. Vortex in polypropyleen conische voor ongeveer 1 uur, of tot het volledig opgelost. Iets meer dan 1 ml van de oplossing is vereist voor elke 10 onderdelen.
6. Spin laag polystyreen oplossing op individuele silicium onderdelen bij 2.400 tpm gedurende 30 sec.
7. Bak gedurende ten minste 5 uur bij 120 ° C.
8. Behandelen met zuurstof plasma (200 mTorr, 200 W) gedurende 1 minuut.

Discussion

Dit systeem is uniek in die zin dat de ruimtelijke organisatie van het weefsel dynamisch worden gemanipuleerd op cellulair niveau mogelijk maakt. Daarom heeft dit apparaat mogelijk een aantal nieuwe biologische experimenten, verspreid over onderwerpen als intercellulaire signalering dynamiek, contact-gemedieerde versus oplosbare signalisatie, cel beslissingen over het lot, toxicologie, en cellulaire overspraak. Dit apparaat moet ruime generaliseerbaar, omdat de cultuur substraat is standaard weefselkweek plastic, en het systeem is compatibel met standaard methoden en cultuur assays. Daarom zijn wij van mening dat dit platform zal de brede belangstelling worden als een instrument voor het bestuderen van cel-cel interactie tussen de verschillende cellen en weefsels.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Silicon Comb Substrates	Tool	N/A	N/A	Parts are available for collaborative research projects. Please contact Elliot Hui (eehui @ alum . mit . edu) or Sangeeta Bhatia (sbhatia @ mit . edu).