I microchip di silicio per la manipolazione di interazione cellula-cellula

Summary

Questo articolo descrive un approccio sperimentale per la regolazione dinamica delle interazioni cellula-cellula tra le cellule aderenti su scala micrometrica. Manipolazione della comunicazione intercellulare tra epatociti e cellule stromali è dimostrata. La piattaforma sviluppata consente di indagine di interazioni cellula-cellula in una varietà di processi biologici, tra cui lo sviluppo e la patogenesi.

Abstract

Il ruolo del microambiente cellulare è riconosciuto come cruciale nel determinare il destino della cellula e la funzione in quasi tutti i tessuti dei mammiferi dallo sviluppo alla trasformazione maligna. In particolare, l'interazione con stroma vicini è stato implicato in una pletora di fenomeni biologici, tuttavia, le tecniche convenzionali limitare la possibilità di interrogare gli elementi spaziali e dinamici di tali interazioni.

In micromeccanica Cultura riconfigurabili (RC), si impiegano un substrato di silicio con microlavorati parti in movimento per controllare dinamicamente interazioni cellula-cellula attraverso il riposizionamento meccanico. In precedenza, questo metodo è stato applicato per studiare la comunicazione intercellulare in co-culture di epatociti e cellule non-parenchimali, dimostrando tempo-dipendente interazioni e una gamma limitata di solubile segnalazione ^1.

Qui, descriviamo in dettaglio la preparazione e l'impiego del sistema RC. Iniziamo dimostrando la movimentazione dei pezzi dispositivo utilizzando una pinzetta, tra cui il divario tra azionamento e configurazioni di contatti (popolazioni di cellule separate da una stretta di 80 micron gap, o in diretto contatto intimo). Successivamente, abbiamo dettaglio il processo di preparazione dei substrati per la cultura, e la multi-step processo semina di cellule necessarie per ottenere monostrati cellulari confluenti. Utilizzando la microscopia viviamo, allora illustrare in tempo reale manipolazione di cellule tra le diverse possibili configurazioni sperimentali. Infine, ci illustra le misure necessarie al fine di rigenerare la superficie del dispositivo per il riutilizzo: toluene e pulizia piranha, il rivestimento in polistirolo, e il trattamento al plasma di ossigeno.

Protocol

Preparazione di colture cellulari:

1. Inizia con le parti in silicone rivestito con plasma trattato polistirolo.
2. Parti cappotto con adeguate proteine ​​della matrice extracellulare di supporto per gli allegati di tipo cellulare desiderato. Per epatociti, incubare a 50 g / ml Collagene-1 soluzione a 37 ° C per 45 min. Per i fibroblasti 3T3, nessuna matrice è necessario.
3. Blocco parti con parti complementari in configurazione contatto.
4. Mettere a bagno in etanolo al 70% per un minimo di 10 minuti per sterilizzare. Sciacquare 2x in DDH ₂ O, e 1 in terreni di coltura delle cellule.
5. Cellule seme ad una concentrazione di 500.000 cellule / ml nel terreno di coltura appropriato. Utilizzare 1 ml in ciascun pozzetto di una 12-pozzetti cultura.
6. Incubare per 1 ora, scuotendo ogni 15 minuti per risospendere le cellule in modo uniforme.
7. Se un monostrato confluenti non è stato raggiunto dopo 1 ora, aspirare la sospensione cellulare e semina ripetere con una sospensione fresca. Ripetere fino a quando la densità cellulare desiderato è stato raggiunto.
8. Rimuovere le parti complementari. Trasferimento parti da pozzi fresco e incubare una notte per consentire alle cellule di aderire e diffondere completamente.
9. Forma di co-culture, bloccando parti appropriate in nessuna il gap o la configurazione di contatto. La configurazione può essere cambiata in qualsiasi punto desiderato durante cultura.
10. Quando si cambiano i media, fare attenzione a lasciare pile a secco per tempo il meno possibile, preferibilmente solo uno o due secondi. Estrarre liquido con una mano e sostituire immediatamente i media usando l'altra mano.

Parti di lavorazione del silicio per il riutilizzo:

1. Striscia di cellule da immersione in candeggina e risciacquare con acqua.
2. Lasciare asciugare completamente le parti. Mettere a bagno in toluene per 2 ore a spogliarsi polistirolo.
3. Pulire in soluzione piranha (1:2 H ₂ O _2: H ₂ SO ₄₎ riscaldato a 120 ° C.
4. Sciacquare per 15 minuti sotto un flusso continuo di DDH ₂ O. Se non si ha intenzione di depositare immediatamente polistirolo, memorizzare le parti in acqua.
5. Sciogliere in polistirene in toluene a 100 mg / ml. Vortex in polipropilene conica per circa 1 ora, o fino a quando completamente sciolto. A poco più di 1 ml di soluzione è necessaria per ogni 10 parti.
6. Spin polistirolo soluzione cappotto su parti singole silicio a 2.400 rpm per 30 sec.
7. Cuocere in forno per almeno 5 ore a 120 ° C.
8. Trattare con plasma di ossigeno (200 mTorr, 200 W) per 1 min.

Discussion

Questo sistema è unico in quanto consente l'organizzazione spaziale del tessuto ad essere manipolato in modo dinamico a livello cellulare. Di conseguenza, questo dispositivo ha permesso una serie di nuovi esperimenti biologici, che coprono argomenti quali le dinamiche di segnalazione intercellulare, contact-mediata rispetto ai segnali solubili, le decisioni il destino della cellula, tossicologia, e diafonia cellulare. Questo dispositivo dovrebbe essere ampiamente generalizzabile in quanto il substrato della cultura è di serie in plastica colture di tessuti, e il sistema è compatibile con i metodi di coltura tradizionali e saggi. Quindi, crediamo che questa piattaforma sarà di ampio interesse come strumento per lo studio delle interazioni cellula-cellula tra molte diverse cellule e tessuti.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Silicon Comb Substrates	Tool	N/A	N/A	Parts are available for collaborative research projects. Please contact Elliot Hui (eehui @ alum . mit . edu) or Sangeeta Bhatia (sbhatia @ mit . edu).